Eredeti cikk dátuma: 2005. augusztus 22.
Eredeti cikk címe: Chloroquine is a potent inhibitor of SARS coronavirus
Eredeti cikk szerzői: Martin J Vincent, Eric Bergeron, Suzanne Benjannet, Bobbie R Erickson, Pierre E Rollin, Thomas G Ksiazek, Nabil G Seidah, Stuart T Nichol
Eredeti cikk elérhetősége: https://tinyurl.com/y7z3una2
Eredeti cikk státusza:
Fordító(k): Szabó Edit
Lektor(ok): Lomen Eszter
Nyelvi lektor(ok):
Szerkesztő(k): Varga Katalin

Figyelem! Az oldalon megjelenő cikkek esetenként politikai jellegű megnyilvánulásokat is tartalmazhatnak. Ezek nem tekinthetők a fordítócsoport politikai állásfoglalásának, kizárólag az eredeti cikk írójának véleményét tükrözik. Fordítócsoportunk szigorúan politikamentes, a cikkekben esetlegesen fellelhető politikai tartalommal kapcsolatosan semmiféle felelősséget nem vállal, diskurzust, vitát, bizonyítást vagy cáfolatot nem tesz közzé.

Az oldalon található információk nem helyettesítik a szakemberrel történő személyes konzultációt és kivizsgálást, ezért kérjük, minden esetben forduljon szakorvoshoz!


Összefoglaló

Háttér

A súlyos akut légzőszervi szindrómát (SARS) az újonnan felfedezett koronavírus (SARS-CoV) okozza. Jelenleg nem áll rendelkezésre hatékony megelőző vagy posztexpozíciós terápia.

Eredmények

Elmondható, hogy a klorokinnek erős antivirális hatása van SARS-CoV fertőzés ellen főemlős sejteken. Ha a sejteket a vírusfertőzés előtt vagy a fertőzés után kezelik a gyógyszerrel a gátló hatás egyaránt megfigyelhető, amely mind megelőzésben, mind terápiában előnyös lehet. A klorokin jól ismert hatásain kívül, például, hogy az endoszomális pH emelkedését okozza, úgy tűnik, hogy a gyógyszer befolyásolja a sejtreceptorja, az angiotenzin-konvertáló enzim 2 (ACE2) terminális glikozilációját. Ez negatívan befolyásolhatja a vírusreceptor kötődését és megakadályozhatja a fertőzést, valamint a vezikuláris pH emelkedés következményeként, a fertőzés gátlása révén a SARS-CoV terjedésének megakadályozását eredményezheti a gyógyszer klinikailag is elfogadható koncentrációjában.

Következtetések

A klorokin hatékonyan megakadályozza a SARS-CoV terjedését a vizsgált sejtvonalon. A vírus terjedésének kedvező gátlását figyelték meg, amikor a sejteket klorokinnel kezelték a SARS-CoV fertőzés előtt vagy után. Ezenkívül az itt ismertetett közvetett immunfluoreszcenciás módszer egy egyszerű és gyors módszer a SARS-CoV anitvirális vegyületeinek vizsgálatára.

Háttér

A súlyos akut légzőszervi szindróma (SARS) egy viszonylag új betegség, amelyet először a kínai Guangdong tartományban jelentettek 2002 végén. A betegség első megjelenése után néhány hónapon belül gyorsan minimum 30 országban elterjedt és a világméretű összehangolt erőfeszítések eredményeként az etológiai kórokozót SARS koronavírusnak (SARS-CoV), a Coronaviridae [1] család új tagjának azonosították. A teljes genom szekvenálás megerősítette, hogy a kórokozó nincs szoros kapcsolatban, az eddig ismert koronavíruscsoportokkal. A SARS-CoV fejlődése a Golgi-apparátusban [4] kezdődik, ahol megtörténik a viriont borító glikoprotein tüskék kialakulása. A tüske glikoprotein egy I típusú membránfehérje, amely megkönnyíti a vírus kötődését a sejtreceptorhoz ezáltal a fertőzés megindulását, valamint az angiotenzin-konvertáló enzim-2 (ACE2)-t azonosították, mint SARS-CoV funkcionális sejtreceptora [5]. Nemrég bebizonyították, hogy a tüskefehérje feldolgozását furinszerű konvertázok hajtják végre, és ennek a hatásnak egy speciális inhibitor általi gátlása megsemmisítette a citopátiát, ami jelentősen csökkentette a SARS-CoV vírustiterét [6].

A SARS-CoV fertőzés súlyossága, a betegség gyors terjedése, valamint a vírus hatékony és biztonságos in vivo gátlóinak hiánya miatt fontos azonosítani azokat a gyógyszereket, amelyek hatékonyan felhasználhatóak lehetnek egy potenciális SARS-CoV fertőzés esetén. Számos új terápiás megközelítést vizsgáltak a SARS-CoV laboratóriumi vizsgálataiban: ezek közül a módszerek közül kiemelkedőek az siRNS [7], a passzív antitest transzfer [8], a DNS oltás [9], a tüskefehérjét expresszáló vaccinia vagy parainfluenza vírus [10] [11], az interferonok [12] [13] és a tüske glikoproteinjének S1 alegységének monoklonális antitestjeinek használata, amelyek gátolják a receptorok kötődését [14]. Jelen munkában bemutatjuk a SARS-CoV fertőzés előtti és utáni vírusellenes szerként hatékonynak bizonyuló klorokin leírását. A klorokin egy 9-amino-kinolin, amelyet 1934-ben azonosítottak, mint gyenge bázist, amely növeli a savas vezikulák pH-ját. Ha extracellulárisan adjuk a sejtekhez, akkor a klorokin nem protonált része belép a sejtben, ahol protonálódik és a savas, alacsony pH-értékű organellumokban, például endoszómákban, Golgi vezikulákban és lizoszómákban halmozódik fel. A klorokin sokféleképpen képes befolyásolni a vírusfertőzést, az antivirális hatása részben attól függ, hogy a vírus milyen mértékben használja az endoszómákat a belépéshez. A klorokint széles körben alkalmazzák olyan emberi megbetegedéseknél jelentősebb káros mellékhatások nélkül [15], mint a malária, amőbiózis, HIV vagy autoimmun megbetegedések. Az itt bemutatott adatokkal együtt, melyek a betegek kezelésével összeegyeztethető klorokin dózist használva mutatja be a vírusgátló hatását sejttenyészetben, azt sugallják, hogy indokolt lenne a SARS-CoV fertőzött állatmodellekben tesztelni a klorokin hatását, mint lehetséges, hatékony antivirális szer a betegség megelőzésére vagy kezelésére.

Eredmények

Preinfekciós klorokinnel végzett kezelés a Vero E6 sejteket ellenállóvá teszi a SARS-CoV fertőzés ellen

Annak kiderítésére, hogy a klorokin megakadályozhatja-e a SARS-CoV fertőzést, a letapadó Vero E6 sejteket [1] különböző klorokin koncentrációval (0,1-10 μM) kezeltük elő a vírusfertőzés előtt 20-24 órával. A sejteket ezután SARS-CoV-val fertőztük és a vírusantigéneket indirekt immunfluoreszcenciával vizsgáltuk, ahogy az Anyag és Módszer fejezetben le van írva. A kontroll sejtek (kezeletlen, fertőzött) mikroszkópos képe (1A. ábra) kiterjedt SARS-CoV-specifikus immunfestést mutatott a monolayeren. A vírus antigénpozitív sejtekben megfigyelhető volt a dózisfüggő csökkenés 0,1 μM klorokintől kezdve, és a 10 μM koncentrációjú klorokin teljesen megszüntette a SARS-CoV fertőzést. Kvanitatív értékeléshez a tárgylemezen három véletlenszerű helyen megszámoltuk a pozitívan festett sejteket. A pozitív kontrollsejtek számát 100%-nak tekintettük, és összehasonlítottuk a különböző klorokin koncentrációk során megfigyelt pozitív sejtek számával (1. B ábra). A 0,1 1, illetve 10 μM klorokines előkezelés 28%, 53% és 100%-kal csökkentette a vírus fertőzőképességét. A megismételhető eredmények három független párhuzamos mérésből származtak. Ezek az adatok azt bizonyítják, hogy a Vero E6 sejtek klorokinnal történő előkezelése ellenállóvá tette azokat a SARS-CoV fertőzéssel szemben.

A fertőzés utáni klorokin kezelés hatékonyan megakadályozza a fertőzés terjedését
1. ábra. A klorokin profilaktikus hatása. A Vero E6 sejteket 20 órán át klorokinnel kezeltük elő. A klorokin-tartalmú médiumot eltávolítottuk, a sejteket foszfát tartalmú sóoldattal mostuk, mielőtt SARS-CoV-vel fertőztük meg őket (0,5-szörös fertőzési multiplicitással) 1 órán át klorokin nélkül. A vírust ezután eltávolítottuk, és a sejteket klorokin nélkül 16–18 órán át Opti-MEM-ben (Invitrogen) tartottuk. A SARS-CoV antigéneket vírusspecifikus HMAF-fel, majd FITC-konjugált másodlagos antitestekkel festettük. (A) A felhasznált klorokin koncentrációját az egyes képek tetején feltüntetjük. (B) A SARS-CoV antigén pozitív sejteket három véletlenszerű helyen rögzítettük digitális kamera segítségével, meghatároztuk az antigén pozitív sejtek számát és kiszámoltuk az átlagos gátlást. A százalékos gátlást úgy kaptuk, hogy a kezeletlen kontrollt 0% -os gátlásnak tekintjük. A függőleges sávok a standard hiba tartományát jelölik.

A fertőzés utáni klorokin kezelés hatékonyan megakadályozza a SARS-CoV fertőzés terjedését

A klorokin a SARS-CoV közvetlen a fertőzés utáni antivirális tulajdonságainak vizsgálata céljából a VERO E6 sejteket megfertőztük a vírussal, majd a vírus adszorpciója után rögtön különböző koncentrációjú klorokint tartalmazó friss médiumot raktunk a sejtekre. A fertőzött sejteket így további 16-18 órán át inkubáltuk, majd a vírusantigének jelenlétét indirekt immunfestéssel vizsgáltuk. Amikor a fertőzés megkezdése után klorokint adtunk a sejtekhez, jelentős dózis-függő csökkenést tapasztaltunk a vírus antigén pozitív sejtek számában (2.A ábra). Még az olyan kevés is, mint 0,1-1 μM klorokin 50%-kal csökkentette a fertőzést és 33-100 μM koncentráció 90-94% gátlást eredményezett (2B ábra). Az 1 μM klorokin koncentrációt meghaladó  esetben csak kis számú egyedi sejt fertőződött meg és a fertőzés a szomszéd sejtekre történő átterjedése szinte megszűnt. Az 50%-os gátló hatás (ED50) a becslések szerint 4.4 ± 1.0 µM klorokinnél jelentkezik (2c ábra). Ezek az adatok egyértelműen azt mutatják, hogy a klorokin adása hatékonyan csökkenti a SARS-CoV fertőzés kialakulását és csökkenését, ha a gyógyszert közvetlenül a vírus adszorpcióját követően alkalmazzák.

2. ábra. A fertőzés utáni klorokin kezelés csökkenti a SARS-CoV fertőzést és terjedését. A Vero E6 sejteket az 1. ábránál leírtak szerint kezeltük és fertőztük, azzal a különbséggel, hogy a klorokint csak a vírus adszorpciója után adtuk hozzá. A sejteket klorokint tartalmazó Opti-MEM-ben (Invitrogen) tartottuk 16-18 órán át, majd immunfluoreszcenciára feldolgoztuk. (A) A klorokin koncentrációja fel van tüntetve. (B) A százalékos gátlást és a standard hibát (SEM) az 1B. Ábra szerint számoltuk. (C) A hatásos dózist (ED50) a kereskedelemben kapható szoftver (Grafit, 4. verzió, Erithacus Software) alkalmazásával számítottuk ki.

Elektronmikroszkópos vizsgálatok során a fertőzés után 5-6 órával jelentős mennyiségű extracelluláris vírusrészecske megjelenését detektálták [16]. Mivel a klorokin vírusellenes hatásait közvetlenül a vírus adszorpciója után figyeltük meg, ezért megvizsgáltuk a vírus adszorpció után 3-5 órával adott klorokin hatását is, a vírusantigének jelenlétét pedig 20 órával később vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a klorokin akkor is szignifikánsan hatékony, ha 5 órával a fertőzés után adtuk a sejtekhez (3. ábra) ugyanakkor az azonos vírusellenes hatás eléréséhez nagyobb klorokin koncentrációra volt szükség, ha a gyógyszert csak 3-5 órával adtuk a fertőzés után.

3. ábra. Időzített fertőzés utáni kezelés klorokinnal. Ez a kísérlet hasonló a 2. ábrán bemutatotthoz, azzal a különbséggel, hogy a sejteket 1-szeres multiplicitással fertőzték meg, és 3 vagy 5 órával a fertőzés után klorokint (10, 25 és 50 μM) adtunk hozzá.

Az ammónium-klorid gátolja a Vero E6 sejtek SARS-CoV fertőzését

Mivel a klorokin gátolta a SARS-CoV fertőzést, amikor a fertőzés előtt vagy után hozzáadtuk a sejtekhez, feltételeztük, hogy egy másik általános lizoszomotróp szer, az NH4Cl is hasonló módon működhet. Az ammónium-kloridot széles körben alkalmazták az endoszómák által közvetített vírus bejuttatására irányuló vizsgálatokban. Véletlen egybeesésként a közelmúltban kimutatták, hogy az NH4Cl csökkenti a SARS-CoV tüskefehérjével rendelkező pszeudotípus vírusok transzdukcióját [17] [18]. Annak kiderítésére, hogy az NH4Cl a klorokinhez hasonlóan működik-e, elvégeztük a fertőzési analíziseket VERO E6 sejtekkel (4A ábra) a fertőzés előtt, majd utána kezelve különböző NH4Cl koncentrációkkal. Mindkét esetben 93-99%-os gátlást figyeltünk meg ≥5 mM NH4Cl koncentráció esetében. Ezek az adatok azt mutatták, hogy az NH4Cl (≥ 5 mM) és a klorokin (≥ 10 μM) nagyon hatékonyan csökkentik a SARS-CoV fertőzést. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a klorokin és az NH4Cl hatásait a SARS CoV fertőzés és terjedés ellenőrzésében hasonló mechanizmus(ok) közvetítheti(k).

4. ábra. Az NH4Cl gátolja a SARS-CoV fertőzés előtti vagy utáni kezelését. NH4Cl-t adtunk a sejtekhez a fertőzés előtt (A), vagy fertőzés után (B) , hasonlóan ahhoz, amit az 1. és 2. ábrán a klorokin esetében tettünk. Az antigén-pozitív sejteket megszámoltuk, és az eredményeket az 1B. ábrán mutatjuk be.

A klorokin és az NH4Cl hatása az ACE2 sejtfelszíni expressziójára

További kísérleteket végeztünk a SARS-CoV gátlásának mechanizmusának tisztázására klorokin és NH4Cl segítségével. Mivel az intravezikuláris savas pH szabályozza a sejtfunkciókat, ideértve az N-glikolizációs mintázat kialakítását, a sejtek traffickingjét, a különféle enzimatikus aktivációkat, érdekes volt megvizsgálni mindkét szer hatását a SAR-CoV glikoportein tüskéjének és annak receptorának, az ACE2-nek kifejeződésére, glikolizációjára és celluláris kiválasztására. Áramlási citometriás analízishez Vero E6 sejteket használtak, melyek vagy kezeletlenek volta vagy rendkívül hatékony anti-SARS-CoV koncentrációjú klorokinnel vagy NH4Cl-al kezeltek. Az eredmények azt mutatták, hogy egyik szer sem okozott szignifikáns változást a sejtfelszíni ACE2 szintjében, jelezve, hogy a SARS-CoV fertőzésre gyakorolt megfigyelt gátló hatások nem a rendelkezésre álló sejtfelszíni ACE2 hiányának tudhatók be (5A ábra). Ezután elemeztük az endogén ACE2 molekuláris formáit kezeletlen Vero E6 sejtekben és olyan sejtekben, amelyeket 1 órán keresztül inkubáltunk különböző koncentrációjú NH4Cl-lel (2,5-10 mM) vagy klorokinnel (1 és 10 μM), majd 35S-(Met)-nal jelöltük a sejteket 3 órán át a vizsgált szerek jelenlétében vagy hiányában (5B. és 5C. ábra). Normál körülmények között két immunreaktiv ACE2 formát figyeltünk meg ~ 105 és ~ 113 kDa magasságában (5B. ábra, 1. sáv). A ~ 105 kDa fehérje endoglikozidáz H érzékeny, ami azt sugallja, hogy az endoplazmás retikulumban (ER) lokalizált formát képviseli, míg a ~ 113 kDa fehérje endoglikozidáz H rezisztens és az ACE2 Golgi-ban módosított formáját jelöli [19].

5. ábra. A lizomotropikus szerek hatása az ACE2 sejtfelszíni expressziójára és bioszintézisére. (A) A Vero E6 sejteket 20 órán át tenyésztjük klorokin (10 μM) vagy NH4Cl (20 mM) vagy ezek hiányában. A sejteket anti-ACE2-vel (szürke hisztogram) vagy csak szekunder ellenanyaggal (fehér hisztogram) jelöltük. (B) ACE2 bioszintézise kezeletlen vagy NH4Cl-dal kezelt sejtekben. A Vero E6 sejteket impulzusjelöléses módszerrel jelöltük 3 órán át 35S-Met-mel, és a sejtlizátumokat immunprecipitáltuk ACE2 antitesttel (1. sáv). Az antitest rekombináns humán ACE2-vel (rhACE2) történő előinkubálása teljesen megszüntette a jelet (2. sáv). Hangsúlyozzuk az ACE2 endoglikozidáz H-érzékeny ER formájának és az endoglikozidáz H-rezisztens Golgi forma helyzetét. Vegye figyelembe, hogy az NH4Cl növekvő koncentrációja az ACE2 Golgi formájának csökkenését eredményezi. (C) Hasonló kísérletet hajtottunk végre a megadott klorokin-koncentrációk jelenlétében. Megjegyzendő a terminális glikánok vesztesége a növekvő klórkinin-koncentrációk következtében. (D) Az ACE2 terminális glikolizációs módosulását immunprecipitált ACE2

Az antitest specifitását az immunreaktív fehérje sávok humán rekombináns ACE2-vel való helyettesítésével igazoltuk (+rhACE2, 5B ábra, 2. sáv). Amikor az ACE2 formákat NH4Cl jelenlétében vizsgáltuk akkor a ~ 113 kDa fehérje vándorlásának egyértelműen fokozatos gyorsulását figyeltük meg az NH4Cl koncentráció növekedésével, a maximális hatás 10mM koncentrációnál volt megfigyelhető, amely azt eredményezte, hogy csak az ACE2 ER formája látható a gélen ( 5B. ábra  3-5 sávok összehasonlításával). Ez arra utalt, hogy az ACE2 N-glikozilezett láncának kialakítását és / vagy terminális módosítását az NH4Cl kezelés befolyásolja. Ezen túlmenően 10 mM NH4CI mellett az ACE2 ER formája enyhén gyorsabb migrációval vándorolt, jelezve, hogy abban a koncentrációban az NH4Cl szintén befolyásolhatja a mag glikozilációját. Megvizsgáltuk az ACE2 terminális glikozilációs állapotát is a sejtek klorokin kezelésének hatására (5C. Ábra). Az NH4Cl-hoz hasonlóan az ACE2 elektroforetikus mobilitásának fokozatos növekedését figyeltük meg a klorokin növekvő koncentrációin belül. 25 μM klorokinnél az ACE2 Golgi-módosított formájának gyorsabb elektroforetikus mobilitása egyértelmű volt. Az áramlási citometria és az immunprecipitációs elemzések alapján arra lehet következtetni, hogy az NH4Cl és a klorokin egyaránt károsítják az ACE2 terminális glikozilációját, de az NH4Cl drámaibb hatást váltott ki. Noha az ACE2 hasonló mennyiségben expresszálódik a sejt felületén, annak glikozilációs státusának változásai csökkenthetik az ACE2-SARS-CoV kölcsönhatást és gátolhatják a vírus bejutását a sejtekbe NH4Cl és klorokin kezelésének hatására.

Annak megerősítésére, hogy az ACE2 végső cukormódosításon megy keresztül, és hogy a terminális glikozilációt befolyásolja az NH4Cl vagy klorokin kezelés, elvégeztük a 35S-sel jelölt ACE2 immunprecipitációját és az immunprecipitátumokat neuraminidáz emésztésnek vetettük alá. A fehérjéket SDS-PAGE-en futtattuk (5D. ábra). Az ACE2 Golgi formájának valamivel gyorsabb mobilitása a neuraminidáz-kezelés után (5D. Ábra, az 1. és 2. sáv összehasonlítása) azt mutatja, hogy az ACE2 terminális glikolizáción megy keresztül; az ACE2 ER formáját azonban a neuraminidáz nem befolyásolta. A 10 µM klorokininnel kezelt sejtek nem okoztak szignifikáns eltolódást; azonban 25 µM klorokin hatására olyan ACE2 Golgi forma jelent meg, mint a neuraminidázzal kezelt ACE2 (5D. ábra, az 5. és a 6. sáv összehasonlítása). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az ACE2 terminális glikolizáción megy keresztül, és hogy az anti-SARS-CoV koncentrációkban a klorokin megakasztja a folyamatot.

A klorokin és az NH4Cl hatása a SARS-CoV tüskefehérje bioszintézisére és feldolgozására

Ezután azt vizsgáltuk, hogy a lizosomotropikus gyógyszerek (NH4Cl és klorokin) befolyásolják-e a SARS-CoV tüske glikoproteinjének bioszintézisét, glikozilációját és / vagy traffickingjét. Erre a célra a Vero E6 sejteket 18 órán át fertőztük a SARS-CoV-val. Klorokint vagy ammónium-kloridot adtunk ezekhez a sejtekhez az éhezés (1 óra), jelölés (30 perc) vagy izotóphígítás (3 óra) szakaszában. A sejtlizátumok immunoprecipitációs analízise során SARS-specifikus poliklonális antitestet használtunk (HMAF). A 30 perces impulzus eredmények azt jelezték, hogy az előtüskéket (proS) ~ 190 kDa prekurzorként (proS-ER) szintetizálták és ~ 125-, ~ 105- és ~ 80 kDa-os fehérjékké dolgozták fel (6A. ábra, 2. sáv), ez az eredmény megegyezik az előbbi megállapításainkkal [6]. A 100 μM-os klorokin kivételével (6A. ábra, 3. sáv) nem volt szignifikáns különbség a vírus tüskefehérjék  bioszintézisében vagy feldolgozásában kezeletlen vagy klorokinnal kezelt sejtekben (6A. ábra, 4–6. sávok). Meg kell jegyezni, hogy a 100 μM-os klorokin a bioszintézis és a feldolgozott vírus glikoprotein szintjének általános csökkenését eredményezte. Tekintettel arra, hogy a tüske-glikoprotein bioszintézisében és feldolgozásában nem csökkent a klorokin-koncentráció (10 és 50 µM) jelenléte, ami nagymértékben csökkentette a SARS-CoV replikációját és terjedését, arra következtetünk, hogy az antivirális hatást valószínűleg nem a vírus glikoproteinek bioszintézisének megváltoztatása és feldolgozása okozza. Hasonló elemzéseket végeztünk NH4Cl-lel, és az adatok azt sugallták, hogy az NH4Cl sem befolyásolja negatívan a tüskefehérje bioszintézisét és feldolgozását (6A. ábra, 7–12. sáv). Korábbi elemzésünkkel összhangban [6] megfigyeltünk egy nagyobb fehérje jelenlétét, amelyet itt oligomernek nevezünk. Nemrégiben Song és mtsai bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy ezek a SARS-CoV tüskefehérje homotrimerei, amelyek beépültek a virionokba [20]. Érdekes módon a homotrimerek szintje a 100 µM klorokinnel és 40 és 20 mM NH4CI-dal kezelt sejtekben (6A. ábra, 3., 9. és 10. sáv) kissé alacsonyabb volt, mint a kontroll sejtekben vagy az alacsonyabb gyógyszerkoncentrációval kezelt sejtekben.

6. ábra. Az NH4Cl és a klorokin (CQ) hatása a SARS-CoV tüskefehérje bioszintézisére, feldolgozására és glikozilációjára. A Vero E6 sejteket SARS-CoV-vel fertőztük a 2. ábránál leírtak szerint. Az éhezés (1h) és a 35S-Cys jelölés (30 perc) ideje alatt CQ-t vagy NH4Cl-t adtunk hozzá, majd jelöletlen táptalaj jelenlétében 3 órán át hígítottuk. A sejteket RIPA pufferben lizáltuk és HMAF-mel immunprecipitáltuk. A vírusfehérjéket 3–8% NuPAGE gélen (Invitrogen) futtatuk. A sejteket 30 percig (A) jelöltük, és 3 órán át (B) hígítottuk. A különféle tüske-molekuláris formák migrációs helyzetét a jobb oldalon, a molekuláris standardokat pedig a bal oldalon mutatjuk be. A proS-ER és a proS-Golgi a SARS-Co pro-tüskéje az ER és a Golgi kompartmentekben, a proS-ungly pedig a nem glikozilezett pro-tüske ER.

A pulse-chase (“impulzusjelöléses”) módszer során (30 perces jelölés és 3 órás hígítás) nyert adatok megerősítették korábbi megfigyelésünket, hogy a SARS-CoV tüskefehérje prekurzora (proSER) Golgi-specifikus módosításokat (proS-Golgi) eredményeként ~ 210 kDa fehérjét hoz létre [6]. A 10, 25 és 50 μM-os klorokin nem gyakorolt lényeges negatív hatást a Golgi-forma megjelenésére (6B. ábra, 2. sávot a 4–6-os sávokkal összehasonlítva). Csak a 100 µM klorokinnél volt megfigyelhető a Golgi-módosított pro-tüske szintjének csökkenése (3. sáv). Másrészt az NH4Cl megsemmisítette a Golgi-módosított formák megjelenését ≥10 mM-on (hasonlítsuk össze a 8. sávot a 9–11-ös értékkel), de enyhébb hatású volt 1 mM-on (12. sáv). Ezek az adatok egyértelműen bizonyítják, hogy a SARS-CoV tüskefehérje bioszintézisét és proteolitikus feldolgozását nem befolyásolja az a klorokin (25 és 50 μM) és az NH4Cl (1 mM) dózis, amely vírusgátló hatást vált ki. Ezen túlmenően 40, 20 és 10 mM NH4Cl alkalmazásával megnövekedett a proS-ER felhalmozódása és az oligomerek mennyiségének ezzel egyidejű csökkenése következett be (6B. ábra, 9–11 sávok). Amikor megvizsgáltuk a homotrimereket, azt találtuk, hogy 100 μM klorokin és 40 és 20 mM NH4Cl a kissé gyorsabb mobilitást eredményez a trimerekben (6B. ábra, 3., 9. és 10. sáv), de az alacsonyabb gyógyszerdózisok, amelyek szignifikáns antivirális hatást mutattak, nem eredményeztek észrevehető különbségeket. Ezek az adatok azt sugallják, hogy az újonnan szintetizált intracelluláris tüskefehérje nem lehet a fő célpontja a klorokin és az NH4Cl az antivirális hatás szempontjából. A trimer gyorsabb mobilitása a szerek bizonyos magasabb koncentrációján azzal magyarázható, hogy ezek a szerek a trimerek terminális glikozilációjára gyakorolják hatásukat.

Megvitatás

A klorokint hatékony SARS-Cov vírusellenes szerként azonosítottuk sejttenyészetben, bizonyítottuk annak gátló hatását, amikor a gyógyszert a fertőzés előtt adtuk hozzá vagy a fertőzés megindulása és kialakulása után. Az a tény, hogy a klorokin antivirális hatást fejt ki a fertőzés előtti és utáni állapotokban, arra utal, hogy valószínűleg mind profilaktikus, mind terápiás előnyei vannak. Nemrégiben Keyaerts és mtsai [21] számoltak be a klorokin antivirális tulajdonságairól, és megállapították, hogy a gyógyszer befolyásolja a SARS-CoV replikációját a sejttenyészetben, amit a kvantitatív RT-PCR-rel bizonyítottak. Ha összevetjük Keyaerts és mtsai [21] eredményeit a mi adatainkkal, elemzésünk további bizonyítékokat szolgáltat arra, hogy a klorokin hatásos a SARS-CoV Frankfurt és Urbani törzsek ellen. Bebizonyítottuk, hogy a klorokin hatékonyan megakadályozza a SARS-CoV fertőzést a sejttenyészetben, ha a szert 24 órával a fertőzés előtt adják a sejtekhez. Ezenkívül a klorokin még akkor is szignifikánsan hatékonynak bizonyult, ha a szert 3–5 órával a fertőzés után adták hozzá, ami antivirális hatásra utal még a fertőzés kialakulása után is. Mivel hasonló eredményeket kaptunk a Vero E6 sejtek NH4Cl kezelésével, ezeknek a szereknek a működési mechanizmusa (i) hasonlóak lehetnek.

A klorokinnak a SARS-CoV replikációban valószínűsíthető szerepén kívül a klorokin SARS-CoV-re gyakorolt hatásmechanizmusa nem teljesen ismert. A korábbi tanulmányok a pH emelkedését javasolták olyan mechanizmusként, amellyel a klorokin csökkenti a SARS-CoV pszeudotípusú vírusok transzdukcióját [17] [18]. Megvizsgáltuk a klorokin és az NH4Cl hatását a SARS-CoV tüskefehérjékre és annak receptorára, az ACE2-re. Az ACE2 immunprecipitációs eredményei egyértelműen kimutatták, hogy a klorokin és az NH4Cl hatékony anti-SARS-CoV koncentrációi szintén befolyásolják az ACE2 terminális glikozilációját. Az áramlási citometriás adatok azonban azt mutatták, hogy az ACE2 sejtfelszíni expressziójában nincs szignifikáns különbség klorokinnel vagy NH4Cl-del kezelt sejtekben. Ezen eredmények alapján ésszerű azt feltételezni, hogy az NH4CI-vel vagy klorokinnel történő előkezelés az alul-glikozilált ACE2 felszíni expresszióját eredményezte. A fertőzést megelőző klorokin kezelés esetén az ACE2 terminális glikozilációjának romlása csökkent ACE2 és SARS-CoV tüskefehérje közötti kötődési affinitást eredményezhet, és negatívan befolyásolhatja a SARS-CoV fertőzés megindulását. Mivel az újonnan szintetizált tüske fehérje bioszintézisét, feldolgozását, Golgi módosítását és oligomerizációját nem befolyásolta érzékelhetően a klorokin vagy az NH4Cl anti-SARS-CoV koncentrációja, arra következtetünk, hogy ezek az események a sejtben a szerek jelenlététől függetlenül fordulnak elő. Azonban nem lehet kizárni ezen szerek potenciális szerepét az endoszomális pH-szint emelkedésében és annak hatását a későbbi vírus be-vagy kijutására. Megfigyeltük, hogy NH4Cl jelenlétében csökken a SARS-CoV pseudotípus-transzdukció, amelyet az intracelluláris pH-értékre gyakorolt hatásnak tulajdonítottak [17] [18]. Ha klorokint vagy NH4Cl-t kezelést alkalmazunk a fertőzés után, ezek a szerek gyorsan növelik a pH-t, és visszaverhetik a vírus és az endoszómák közötti folyamatos fúziós eseményeket, ily módon gátolva a fertőzést.

Ezenkívül az NH4Cl és a klorokin hatásmechanizmusa attól függ, hogy mikor adták őket a sejtekhez. Ha a fertőzés megkezdése után adják a sejtekhez, akkor ezek a szerek befolyásolhatják az endoszóma által közvetített fúziót, az azt követő vírus replikációt vagy a vírus összeépülésétés a felszabadulást. A klorokin korábbi tanulmányai kimutatták, hogy az endoszomális pH emelkedésén túlmenően többféle hatást gyakorol az emlős sejtekre, ideértve az immunoglobulinok terminális glikozializációjának megakadályozását is [22]. A vírussal fertőzött sejtekhez adva a klorokin a sejtek felületén [23] a glikoprotein expressziójának gátlásával gátolta a vezikuláris sztomatitisz vírus későbbi szakaszát, valamint gátolta a fertőző HIV-1 részecskék képződését azáltal, hogy megzavarja a glikoprotein terminális glikolizációját [24] [25]. Ezen tulajdonságok alapján feltételezzük, hogy az alul-glikolizált ACE2 sejtfelszíni expressziója és a SARS-CoV tüskefehérjéhez való alacsony affinitása lehet az elsődleges mechanizmus, amellyel a fertőzést megakadályozzák azááltal, hogy a sejteket a fertőzés előtt előkezelik a szerrel. Másrészt az endoszomális pH gyors emelkedése és a vírus-endoszóma fúzió megszakítása lehet az elsődleges mechanizmus, amellyel a vírusfertőzés megelőzhető a kezelés utáni körülmények között. Ezután részletesen megvizsgáltuk a SARS-CoV tüske-ACE2 kötődését klorokin jelenlétében és annak hiányában megállapításaink megerősítésére. Kutatásaink azt mutatták, hogy a NH4Cl és a klorokin hatására az ACE2 és a tüskefehérje profiljai jelentősen különböztek. Az NH4Cl kifejezettebb hatást gyakorol, mint a klorokin a terminális glikozilációra, kiemelve a klorokin és az ammónium-klorid közötti új, bonyolult különbségeket a SARS-CoV tüskefehérje és receptorának, az ACE2 proteinszállításának vagy glikozilációjának befolyásolásában annak ellenére, hogy alaposan bebizonyítottuk az endoszomális pH-szint megemelkedését a szerek hatására.

A SARS-CoV-től eltérő koronavírusok fertőzőképességét szintén befolyásolja a klorokin, amint ezt az emberi CoV-229E példája szemlélteti [15]. A SARS-CoV fertőzőképességére és a sejtek közötti terjedésére megfigyelt gátló hatások 1–10 µM klorokin jelenlétében fordultak elő, amelyek a malária megelőzésében és kezelésében elérhető plazmakoncentrációknak megfelel (1,6–12,5 µM között változnak), ezért a betegek is jól tolerálják [26]. Nemrégiben felvetették, hogy a klorokin hatásos lehet a SARS ellen, és a szerzők azt sugallták, hogy ez a vegyület gátolhatja a TNFa, IL6 vagy IFNy termelését [15]. Adataink bizonyítékokkal szolgálnak a jól bevált klorokin gyógyszer felhasználhatóságáról a SARS klinikai kezelésében.

Konklúzió

A klorokin, egy viszonylag biztonságos, hatékony és olcsó gyógyszer, amelyet számos emberi betegség kezelésére használnak, ideértve a malária, abőbiázist és a HIV-et, hatékonyan gátolja a SARS CoV fertőzését és terjedését a sejttenyészetben. Az a tény, hogy a gyógyszer szignifikáns gátló antivirális hatással mutatott, amikor a fogékony sejteket a fertőzés előtt vagy után kezelték, egy lehetséges profilaktikus és terápiás felhasználásra utal.

Módszerek

SARS-CoV fertőzés, immunfluoreszcencia, immunprecipitációs analízis

VeroE6 sejteket (afrikai zöld majom vese sejtvonal) SARS-CoV (urbani törzs) fertőztünk 0,5-szörös fertőzési multiplicitással 1 órán keresztül. A sejteket PBS-sel mostuk, majd különböző mennyiségű klorokint vagy NH4Cl-ot (mindkettő Sigma), illetve egyiket sem tartalmazó OPTI-MEM (Invitrogen) médiumban inkibáltuk.Az immunfluoreszcencia festéshez SARS-CoV specifikus hiperimmunizált egér ascites (HMAF) [8] folyadékot használtunk, majd pedig egér elleni fluoreszceinnel jelölt antitestet.

Tizennyolc órával a fertőzés után a vírust tartalmazó felülúszókat eltávolítottuk, a pulse-chase (“impulzusjelöléses”) módszert alkalmazva a sejteket 30 percig jelöltük ciszteinnel (35S), majd 3 órás hígítás után RIPA pufferben lizáltuk. A tisztított sejtlizátumokat és a táptalajokat HMAF-el inkubáltuk, az immunprecipitált fehérjéket 3-8%-os NuPAGE gélen (Invitrogén) futtattuk, a fehérjéket autográfiával vizualizáltuk. Néhány kísérletben a sejtek 3 órás izotópmentes tápban tartása után a tisztított felülúszókat szintén SARS-CoV specifikus HMAF-el immunprecipitáltuk.

ACE2 áramlási citometriás analízise és bioszintézise

A VERO E6 sejteket 10% újszülött borjú szérumot (FBS) tartalmazó Dulbecco’s modified Eagle mediumban (DMEM, Invitrogén) tenyésztettük. Másnap a sejteket Opti-MEM-ben (Invitrogén) inkubáltuk 10 μM klorokin vagy 20mM NH4Cl jelenlétében vagy hiányában. A sejtfelszíni ACE2 szintjének meghatározásához a sejteket jégen 10 μg/ml koncentrációjú kecske anti ACE2 antitesttel (R&D Systems) inkubáltuk, majd FITC-cel jelölt kecske ellen termeltetett sertés IgG antitesttel jelöltük (Caltag Laboratories). A jelölt sejteket FACSCalibur áramlási citométerrel (BD Biosciences) elemeztük. Az ACE2 bioszintézis vizsgálatához a Vero E6 sejteket 3 órán át 250 μCi 35S- (Met) -vel (Perkin Elmer) pulzáltuk a megadott klorokin vagy NH4CI koncentrációval, majd lizáltuk RIPA pufferben. A tisztított lizátumokat immunprecipitáltuk affinitás alapján tisztított kecske anti-ACE2 antitesttel (R&D Systems), és az immunprecipitált fehérjéket SDS-poliakrilamid gélen futtattuk.

Összeférhetetlenségi nyilatkozat

A szerző(k) kijelentik, hogy nem áll fenn összeférhetetlenség.

Szerzői hozzájárulás

MV a SARS-CoV fertőzéssel kapcsolatos összes kísérletet elvégezte, és összehangolta a kézirat elkészítését. EB és SB az ACE2 bioszintézisével és a FACS elemzéssel kapcsolatos kísérleteket végezte. BE immunfluoreszcencia kísérletek adatelemzését végezte. PR és TK reagenseket szolgáltattak, és a kéziratot kritikusan felülvizsgálták. NS és SN, valamint MV és EB részt vett a kísérletek tervezésében, az adatok áttekintésében és értelmezésében, valamint a kézirat kritikus áttekintésében. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a kézirat tartalmát.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Claudia Chesley-nek és Jonathan Townernek a kézirat kritikus elolvasását. Ez a munka a kanadai PENCE-támogatás (T3), a CIHR csoport támogatása #MGC 64518 és a CIHR-támogatás # MGP-44363 (az NGS-nek nyújtott támogatás) segítségével valósult meg.

Irodalomjegyzék

1. Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S,Tong S, Urbani C, Comer JA, Lim W, Rollin PE, Dowell SF, Ling AE,Humphrey CD, Shieh WJ, Guarner J, Paddock CD, Rota PB, Fields B,DeRisi J, Yang JY, Cox N, Hughes J, LeDuc JW, Bellini WJ, AndersonLJ, SARS Working Group: A novel coronavirus associated withsevere acute respiratory syndrome.N Engl J Med 2003,348:1953-1966.
2. Marra MA, Jones SJ, Astell CR, Holt RA, Brooks-Wilson A, ButterfieldYS, Khattra J, Asano JK, Barber SA, Chan SY, Cloutier A, Coughlin SM,Freeman D, Girn N, Griffith OL, Leach SR, Mayo , McDonald H,Montgomery SB, Pandoh PK, Petrescu AS, Robertson AG, Schein JE,Siddiqui A, Smailus DE, Stott JM, Yang GS, Plummer F, Andonov A,Artsob H, Bastien N, Bernard K, Booth TF, Bowness D, Czub M,Drebot M, Fernando L, Flick R, Garbutt M, Gray M, Grolla A, Jones S,Feldmann H, Meyers A, Kabani A, Li Y, Normand S, Stroher U, TipplesGA, Tyler S, Vogrig R, Ward D, Watson B, Brunham RC, Krajden M,Petric M, Skowronski DM, Upton C, Roper RL: The Genomesequence of the SARS-associated coronavirus.Science 2003,300:1399-1404.
3. Rota PA, Oberste MS, Monroe SS, Nix WA, Campagnoli R, IcenogleJP, Penaranda S, Bankamp B, Maher K, Chen MH, Tong S, Tamin A,Lowe L, Frace M, DeRisi JL, Chen Q, Wang D, Erdman DD, Peret TC,Burns C, Ksiazek TG, Rollin PE, Sanchez A, Liffick S, Holloway B,Limor J, McCaustland K, Olsen Rasmussen M, Fouchier R, Gunther S,Osterhaus AS, Drosten C, Pallansch MA, Anderson LJ, Bellini WJ:Characterization of a novel coronavirus associated withsevere acute respiratory syndrome.Science 2003,300:1394-1399.
4. Ng ML, Tan SH, See EE, Ooi EE, Ling AE: Proliferative growth ofSARS coronavirus in Vero E6 cells.J Gen Virol 2003,84:3291-3303.
5. Li M, Moore WJ, Vasilieva N, Sui J, Wong SK, Berne MA, Somasunda-ran M, Sullivan JL, Luzuriaga K, Greenough TC, Choe H, Farzan M:Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor forthe SARS coronavirus.Nature 2003, 426:450-454.
6. Bergeron E, Vincent MJ, Wickham L, Hamelin J, Basak A, Nichol ST,Chrétien M, NG Seidah: Implication of proprotein convertasesin the processing and spread of severe acute respiratory syn-drome coronavirus.Biochem Biophys Res Comm 2005,326:554-563.
7. Zhang Y, Li T, Fu L, Yu C, Li Y, Xu X, Wang Y, Ning H, Zhang S, ChenW, Babiuk LA, Chang Z: Silencing SARS-CoV spike proteinexpression in cultured cells by RNA interference.FEBS Lett2004, 560:141-146.
8. Subbarao K, McAuliffe J, Vogel L, Fahle G, Fischer S, Tatti K, PackardM, Shieh WJ, Zaki S, Murphy B: Prior infection and passive trans-fer of neutralizing antibody prevent replication of severeacute respiratory syndrome coronavirus in the respiratorytract of mice.J Virol 2004, 78:3572-3577.
9. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K,Nabel GJ: A DNA vaccine induces SARS coronavirus neutral-ization and protective immunity in mice.Nature 2004,428:561-564.
10. Bisht H, Roberts A, Vogel L, Bukreyev A, Collins PL, Murphy BR, Sub-barao K, Moss B: Severe acute respiratory syndrome corona-virus spike protein expressed by attenuated vaccinia virusprotectively immunizes mice.Proc Natl Acad Sci USA 2004,101:6641-6646.
11. Bukreyev A, Lamirande EW, Buchholz UJ, Vogel LN, Elkins WR, St.Claire M, Murphy BR, Subbarao K, Collins PL: Mucosal immuniza-tion of African green monkeys (Cercopithecus aethiops)with an attenuated parainfluenza virus expressing the SARScoronavirus spike protein for the prevention of SARS.Lancet2004, 363:2122-2127.
12. Sainz B Jr, Mossel EC, Peters CJ, Garry RF: Interferon-beta andinterferon-gamma synergistically inhibit the replication ofsevere acute respiratory syndrome-associated coronavirus(SARS-CoV).Virology 2004, 329:11-17.
13. Stroher U, DiCaro A, Li Y, Strong JE, Aoki F, Plummer F, Jones SM,Feldmann H: Severe acute respiratory syndrome-related coro-navirus is inhibited by interferon- alpha.J Infect Dis 2004,189:1164-1167.
14. Sui J, Li W, Murakami A, Tamin A, Matthews LJ, Wong SK, Moore MJ,Tallarico AS, Olurinde M, Choe H, Anderson LJ, Bellini WJ, Farzan M,Marasco WA: Potent neutralization of severe acute respira-tory syndrome (SARS) coronavirus by a human mAb to S1protein that blocks receptor association.Proc Natl Acad Sci USA2004, 101:2536-2541.
15. Savarino A, Boelaert JR, Cassone A, Majori G, Cauda R: Effects ofchloroquine on viral infections: an old drug against today’sdiseases?Lancet Infect Dis 2003, 3:722-727.
16. Ng ML, Tan SH, See EE, Ooi EE, Ling AE: Early events of SARScoronavirus infection in vero cells.J Med Virol 2003, 71:323-331.
17. Simmons G, Reeves JD, Rennekamp AJ, Amberg SM, Piefer AJ, BatesP: Characterization of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus (SARS-CoV) spike glycoprotein-mediated viral entry.Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101:4240-4245.
18. Yang ZY, Huang Y, Ganesh L, Leung K, Kong WP, Schwartz O, Sub-barao K, Nabel GJ: pH-dependent entry of severe acute respi-ratory syndrome coronavirus is mediated by the spikeglycoprotein and enhanced by dendritic cell transfer throughDC-SIGN.J Virol 2004, 78:5642-5650.
19. Tipnis SR, Hooper NM, Hyde R, Karran E, Christie G, Turner AJ: Ahuman homolog of angiotensin-converting enzyme. Cloningand functional expression as a captopril-insensitivecarboxypeptidase.J Biol Chem 2000, 275:33238-33243.
20. Song HC, Seo MY, Stadler K, Yoo BJ, Choo QL, Coates SR, UematsuY, Harada T, Greer CE, Polo JM, Pileri P, Eickmann M, Rappuoli R,Abrignani S, Houghton M, Han JH: Synthesis and characterizationof a native, oligomeric form of recombinant severe acuterespiratory syndrome coronavirus spike glycoprotein.J Virol2004, 78:10328-10335.
21. Keyaerts E, Vijgen L, Maes P, Neyts J, Ranst MV: In vitro inhibitionof severe acute respiratory syndrome coronavirus bychloroquine.Biochem Biophys Res Commun 2004, 323:264-268.
22. Thorens B, Vassalli P: Chloroquine and ammonium chlorideprevent terminal glycosylation of immunoglobulins inplasma cells without affecting secretion.Nature 1986,321:618-620.
23. Dille BJ, Johnson TC: Inhibition of vesicular stomatitis virusglycoprotein expression by chloroquine.J Gen Virol 1982,62:91-103.
24. Tsai WP, Nara PL, Kung HF, Oroszlan S: Inhibition of humanimmunodeficiency virus infectivity by chloroquine.AIDS ResHum Retroviruses 1990, 6:481-489.
25. Savarino A, Lucia MB, Rastrelli E, Rutella S, Golotta C, Morra E, Tam-burrini E, Perno CF, Boelaert JR, Sperber K, Cauda RC: Anti-HIVeffects of chloroquine: inhibition of viral particle glycosyla-tion and synergism with protease inhibitors.J Acquir ImmuneDefic Syndr 2004, 35:223-232.
26. Ducharme J, Farinotti R: Clinical pharmacokinetics and metab-olism of chloroquine. Focus on recent advancements.ClinPharmacokinet 1996, 31:257-274.