Eredeti cikk dátuma: 2020. január 24.
Eredeti cikk címe: A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019
Eredeti cikk szerzői: Na Zhu, Ph.D., Dingyu Zhang, M.D., Wenling Wang, Ph.D., Xingwang Li, M.D., Bo Yang, M.S., Jingdong Song, Ph.D., Xiang Zhao, Ph.D., Baoying Huang, Ph.D., Weifeng Shi, Ph.D., Roujian Lu, M.D., Peihua Niu, Ph.D., Faxian Zhan, Ph.D., Xuejun Ma, Ph.D., Dayan Wang, Ph.D., Wenbo Xu, M.D., Guizhen Wu, M.D., George F. Gao, D.Phil., and Wenjie Tan, M.D., Ph.D., .
Eredeti cikk elérhetősége: https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa2001017
Eredeti cikk státusza:
Fordító(k): dr. Fodor Hanna Ágota, dr. Palatinszky Márton
Lektor(ok): dr. Benedek-Kováts Emese
Nyelvi lektor(ok):
Szerkesztő(k): Novák Zsuzsanna
Figyelem! Az oldalon megjelenő cikkek esetenként politikai jellegű megnyilvánulásokat is tartalmazhatnak. Ezek nem tekinthetők a fordítócsoport politikai állásfoglalásának, kizárólag az eredeti cikk írójának véleményét tükrözik. Fordítócsoportunk szigorúan politikamentes, a cikkekben esetlegesen fellelhető politikai tartalommal kapcsolatosan semmiféle felelősséget nem vállal, diskurzust, vitát, bizonyítást vagy cáfolatot nem tesz közzé.
Az oldalon található információk nem helyettesítik a szakemberrel történő személyes konzultációt és kivizsgálást, ezért kérjük, minden esetben forduljon szakorvoshoz!
Összegzés
2019 decemberében ismeretlen okú tüdőgyulladásos betegek egy csoportját a Hupej tartománybeli Vuhan város tenger gyümölcseit áruló nagykereskedelmi piacával hozták összefüggésbe. A tüdőgyulladásos betegekből nyert mintákból nagypontosságú szekvenálás során egy korábban ismeretlen béta-koronavírust mutattunk ki. Az új típusú koronavírust (SARS-CoV-2), amely az Orthocoronavirinae család sarbecovirus alnemzetségbe tartozik, humán légúti epiteliális sejtekből izoláltuk. A SARS-CoV-2 a SARS és MERS vírusoktól különbözik, az embert is megfertőző koronavírusok családjának hetedik tagja. További vizsgálatok, nyomon követés folyamatban vannak. (Finanszírozta: National Key Research and Development Program of China, National Major Project for Control and Prevention of Infectious Disease in China.)
Az újonnan és az ismételten megjelenő kórokozók a közegészségügyet globális kihívások elé állítják. (1) A légúti, enterális,
hepatikus és neurológiai betegségeket okozó koronavírusok burkos RNS-vírusok, melyek széles körben tudnak terjedni emberek, egyéb emlősök és madarak között.2,3 Hat fajta koronavírusról ismert, hogy emberi megbetegedést okoz. (4) A négy gyakori típus (229E, OC43, NL63, és HKU1) az immunkompetens személyeknél jellegzetes megfázásos tüneteket okoz. (4)
A csoport másik két kórokozója, a severe acute respiratory syndrome koronavírus (SARS-CoV) és a Middle East respiratory syndrome koronavírus (MERS-CoV) zoonózis útján terjed, és halálos megbetegedést is okozott. (5) A SARS-CoV 2002-ben és 2003-ban Kína Guangdong tartományában okozott súlyos akut légzőszervi szindrómával járó járványokat. (6-8) A MERS-CoV pedig a 2012-es közel-keleti, súlyos légzőszervi megbetegedésekkel járó járványért volt felelős. (9) Gyakori előfordulásuknak, széles körű elterjedtségüknek, nagy genetikai diverzitásuknak, a genetikai anyag gyakori rekombinációjának és az egyre gyakoribbá váló ember-állat kapcsolatnak köszönhetően az új típusú koronavírusok várhatóan periodikus fertőzéseket fognak okozni az emberekben, és így gyakran fajok közötti, alkalmanként pedig továbbterjedő fertőzésekkel kell szembenéznünk. (5,10)
2019 december végén Kínában, a Hupej tartománybeli Vuhan városában különböző helyi egészségügyi intézmények ismeretlen eredetű tüdőgyulladásban szenvedő betegek csoportjait jelentették, akik járványtani szempontból mind egy tenger gyümölcseit és egyéb vízi állatokat árusító nagykereskedelmi piaccal (halpiaccal) voltak összefüggésbe hozhatóak. (11) 2019 december 31-én a kínai Járványvédelmi és Járványmegelőzési Központ (China CDC) egy gyorsreagálású csoportot küldött Hupej tartomány és Vuhan város egészségügyi hatósága mellé, hogy járványtani és etiológiai vizsgálatokat végezzenek.
Jelen beszámolóban a vizsgálat eredményeiről, a tüdőgyulladást okozó fertőzés forrásának azonosításáról írunk, illetve jellemezzük azt az új típusú koronavírust, amelyet a kínai CDC a járvány korai szakaszában a tüdőgyulladásban szenvedő betegek mintáiból kinyert. Két beteg esetén pedig a tüdőgyulladás klinikai jellemzőiről is szólunk.
Módszerek
Vírusdiagnosztikai módszerek
Négy alsó légúti mintát, többek között bronchoalveoláris lavage (mosó-) folyadékot gyűjtöttünk azoktól az ismeretlen okú tüdőgyulladásban szenvedő betegektől, akiket 2019. december 21-én, vagy később Vuhanban diagnosztizáltak, és akik jártak a Huanan piacon a tüneteik megjelenése körül. Kontrollként hét bronchoalveoláris lavage minta szolgált, amelyet pekingi kórházakban, ismert etiológiájú tüdőgyulladásos betegek körében gyűjtöttek. A mintákból (beleértve a negatív kontrollként szolgáló nem fertőzött mintákat) a nukleinsavak extrakciója Roche-féle High Pure Viral Nucleic Acid Kit-tel történt. (12) A kinyert nukleinsav mintákban 18 különböző vírust és 4 baktériumot vizsgáltunk a gyártó utasításai szerint végzett PCR reakcióval (RespiFinderSmart22kit – PathoFinder BV, és Light-Cycler 480 real-time PCR). Ezenkívül korábban ismertetett nagypontosságú, nagy áteresztőképességű szekvenálást végeztünk (13), hogy a PCR módszerrel nem
detektálható mikrobiális szekvenciákat is vizsgálni tudjuk. A vírus RNS panβ-CoV RdRp régióján végeztünk valós idejű reverz transzkripciós PCR (RT-PCR) assay-t.
Vírusizoláció
A bronchoalveoláris lavage mintákat vírus transzport médiumot tartalmazó steril kémcsövekbe gyűjtöttük. Ezt követően, a sejttörmelék eltávolítása céljából, a mintákat centrifugáltuk. A felülúszó folyadékot humán légúti epiteliális sejtekre oltottuk be (13), amelyek tüdőrák miatt műtéten átesett betegekből származtak, és az NGS (Next Generation Sequencing) alapján kórokozót nem tartalmaztak. (14) A humán légúti epiteliális sejttenyészetet első passzázsként műanyag edénybe szélesztettük, majd 2,5 x 10^5 sejtsűrűséggel Transwell-COL (12-mm átmérőjű) betétekre (support) plételtük. Az epiteliális sejttenyészetet 4-6 hétig növesztettük egy folyadék-levegő határfelületi kultúrában, amíg diff erenciált, polarizált légzőhámra hasonlító szövetet „pseudostratifi ed mucociliary epithelium” nem kaptunk (13). A vírussal történő beoltás előtt a sejttenyészet apikális felszínét háromszor PBS-sel mostuk, majd 150 μl bronchoalveoláris lavage felülúszóval beoltottuk. Két órás 37°C-os inkubációt követően a nem megkötődött vírusokat eltávolítottuk 10 perces, 500 μl PBS-sel történő mosással. Az epiteliális sejttenyészetet 37°C-on, 5% CO2 mellett inkubáltuk folyadék-levegő határfelületi kultúrában. 48 óránként 150 PBS-t pipettáztunk a sejtteny szet apikális felszínére, majd 10 perces 37°C-os inkubáció után leszívtuk az így nyert felülúszó mintákat. A légzőhám tenyészetet ugyanezen inkubációs paraméterek mellett tartottuk fenn, a levett apikális folyadékmintákat 1:3-as hígításban új sejttenyészetre passzáltuk. A sejteket naponta monitoroztuk mikroszkóppal citopatikus elváltozások tekintetében, illetve RT-PCR-rel a felülúszóban virális nukleinsavakat keresve. Három passzálás után az apikális mintákat és a légzőhám sejttenyészet mintákat transzmissziós elektronmikroszkópiához (TEM) készítettük elő.
Transzmissziós elektronmikroszkópia
A citopatikus hatásokat mutató légzőhám sejttenyészetekről származó felülúszókat 2%-os paraformaldehiddel inaktiváltuk 2 órán át, majd ultracentrifugában kiülepítettük a vírusrészecskéket. Az ily módon bekoncentrált felülúszókat hártyás grideken negatívan festettük. A citopatikus hatásokat mutató légzőhám sejteket szuszpenzióban 2% paraformeldehid és 2,5%-os glutáraldehid oldattal fi xáltuk, majd 1%-os ozmium tetroxiddal kezeltük, etanollal dehidratáltuk, majd PON812 műgyantába ágyaztuk. 80 nm-es ultravékony metszeteket vágtunk és uranil-acetáttal illetve ólom-citráttal festettük. A negatívan festett grideket illetve az ultravékony metszeteket transzmissziós elektronmikroszkóppal elemeztük.
Vírus genom szekvenálás
A klónozáshoz és szekvenáláshoz a bronchoalveoláris lavage minták illetve a sejttenyészetek felülúszói szolgáltak templátként. llumina és Nanopore platformok kombinációját használtuk a vírusgenom szekvenálásához. A szekvenciából CLC Genomics ver. 4.6.1 (CLC Bio) programmal készítettünk kontigokat. Ezután specifi kus PCR primereket terveztünk és 5’- vagy 3’-RACE (rapid amplifi cation of cDNA ends) technikával illetve hagyományos Sanger szekvenálással határoztuk meg a hiányzó genomrészeket. A PCR termékeket gélből visszaizolálva tisztítottuk meg és BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit-
tel, 3130XL Genetic Analyzer-en szekvenáltuk a gyártó utasításai szerint. A szekvenciaillesztéseket Muscle algoritmussal végeztük a SARS-CoV-2 és a referencia genomok között. A teljes genomok fi logenetikai analízisét RAxML (13) szoftverrel végeztük 1000 bootstrap ismétléssel és nukleotid-szubsztitúciós modellként a general time-reversible (GTR) modellt alkalmaztuk.
Eredmények
Betegek
2019 december 27-én a vuhani kórházba három felnőtt korú beteget vettek fel súlyos tüdőgyulladással. Az első számú beteg egy 49 éves nő, a második számú beteg egy 61 éves férfi , a harmadik számú beteg egy 32 éves férfi volt. Az 1-es és a 2-es számú beteg kórtörténete volt elérhető. Az 1-es számú beteg 2019. december 23-án mellkasi diszkomfort érzéssel járó köhögéssel, 37-38°C közötti hőmérséklettel jelentkezett, ugyanakkor krónikus megbetegedésről nem számolt be. Négy nappal a betegség kezdetét követően köhögése és mellkasi diszkomfort érzése fokozódott, hőemelkedése azonban csökkent. CT vizsgálattal tüdőgyulladás diagnózisát állították fel. Foglalkozását tekintve egy tenger gyümölcseit áruló nagykereskedelmi piacon volt eladó. A 2-es számú beteget 2019. december 20-án láz és köhögés miatt vizsgálták, majd a betegség kezdetét követően 7 nappal légzési nehezítettsége jelentkezett, amely a következő két nap alatt oly mértékben rosszabbodott (lsd. 1. ábra), hogy gépi lélegeztetés vált szükségessé. Anamnéziséből kiderült, hogy gyakran megfordult az említett halpiacon. Az 1-es és 3-as számú beteg meggyógyult, 2020. január 16-án bocsátották haza őket. A 2-es számú beteg 2020. január 9-én meghalt, biopsziás mintavétel nem történt.
Az új típusú koronavírus detektálása és izolálása
2019 december 30-án a vuhani Jinyintan Kórházból három bronchoalveoláris lavage mintát gyűjtöttünk. A RespiFinderSmart- 22kit használatával specifikus patogént (többek között HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, and HCoV-HKU1) ezekben a minták ban nem detektáltunk. A betegek mintájából nyert RNS-t templátként használtuk a genom klónozására
és szekvenálására Illumina szekvenálási és nanopore szekvenálási módszert kombinálva.
Több mint 20 000 vírusszekvenciát nyertünk ki, melyekből a legtöbb kontig a béta-koronavírus nemzetség B ágához illeszkedett, 85%-nál is nagyobb hasonlóságot mutatva egy korábban publikált denevér SARS-jellegű koronavírus genomhoz (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1). Pozitív eredményeket kaptunk real-time RT-PCR használatával, a β-CoV RdRp konszenzus régióját célozva is (bár a ciklusszám küszöb 34-nél is magasabb volt a mintáink esetében). A klinikai mintákból a vírust humán légúti epiteliális sejteken, illetve Vero E6 és Huh-7 sejtvonalakon izoláltuk. Az izolált vírust SARS-CoV-2-nak neveztük el.
Hogy eldönthessük, a vírus detektálható-e SARS-CoV-2-fertőzött humán légúti epiteliális sejtekben, mesterségesen fertőzött, illetve SARS-CoV-2-fertőzött humán légúti epiteliális sejteket vizsgáltunk napi gyakorisággal fénymikroszkópos, illetve fertőzés után 6 nappal elektronmikroszkópos technikával.
96 órával a fertőzés után a humán légúti epiteliális sejtek felszínén citopatikus hatást tapasztaltunk; a csillók mozgásának hiányát detektáltuk fénymikroszkóppal (2. ábra). A Vero E6 és Huh-7 sejtvonalakon nem tapasztaltunk citopatikus hatást
a fertőzés után 6 nappal sem.
Az elektronmikroszkópos felvételeken a SARS-CoV-2 vírusrészecskék általában gömb alakúak voltak, némi pleomorfizmussal (3. ábra). Az átmérőjük 60 és 140 nm között változott. A vírusrészecskéknek jól felismerhető 9-12 nm-es tüskéik voltak, melyek napkorona jellegű alakot kölcsönöztek a virionoknak. A humán légúti epithélium ultravékony metszetein extracelluláris szabad vírusrészecskéket, valamint a membrán-eredetű vezikulumokban vírusrészecskékkel telt zárványokat is találtunk a sejtek citoplazmájában. Ez a megfi gyelt morfológia konzisztens a Coronaviridae családban tapasztaltakkal.
A vírus részletesebb karakterizálása végett de novo SARS-CoV-2 genom szekvenciákat határoztunk meg klinikai (bronchoalveoláris lavage) mintákból és humán légúti epiteliális sejttenyészet vírus-izolátumokból Illumina és Nanopore szekvenálással.
Az új koronavírust mindhárom betegből kimutattuk. Két csaknem teljes koronavírus szekvenciát nyertünk bronchoalveoláris lavage mintákból (BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020, BetaCoV/Wuhan IVDC-HB-05/2020|EPI_ISL_402121), és egy teljes szekvenciát egy betegből izolált vírusból (Beta-CoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2020|EPI_ISL_402119).
Mindhárom komplett genomszekvenciát feltöltöttük a GISAID adatbázisba (BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019, accession ID: EPI_ISL_402119; Beta-CoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020, accession ID: EPI_ISL_402120; BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019,
accession ID: EPI_ISL_402121), s ezek 86.9% bázissorrend egyezést mutattak egy korábban publikált denevér SARS-jellegű koronavírus genomhoz (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1). A három SARS-CoV-2 genom együtt tagozódott be a sarbecovirus alnemzetségbe, melyek tipikus béta-koronavírus jegyeket mutatnak: egy 5’ nem kódoló régió (UTR), replikáz komplex (orf1ab), S gén, E gén, M gén, N gén, 3’ UTR, és több azonosítatlan nem-szerkezeti nyitott leolvasási keret (ORF).
Bár a SARS-CoV-2 hasonló pár béta-koronavírushoz, melyeket denevérekben detektáltak, különbözik a SARS-CoV-tól és a MERS-CoV-tól (4. ábra). A három Vuhanban izolált SARS-CoV-2 két denevér-eredetű SARS-szerű törzzsel (ZC45, ZXC21) együtt egy külön leszármazási ágat alkot. Az emberből származó SARS-CoV törzsek és genetikailag hasonló SARS-szerű, délnyugat-kínai denevérekben található koronavírusok egy másik ágat alkotnak a sarbecovirus alnemzetségen belül. Mivel a konzervált replikáz domén (ORF1ab) szekvenciaegyezése kevesebb, mint 90% a SARS-CoV-2 és más béta-koronavírusok között, elmondható, hogy a SARS-CoV-2 – a vuhani vírusos tüdőgyulladás járvány feltételezhető kórokozója – egy új béta koronavírus, mely a Coronaviridae család sarbecovirus alnemzetségébe tartozik.
Megbeszélés
Munkánk során új típusú koronavírust azonosítottunk a 2019 decemberében és 2020 januárjában Vuhan város 2 kórházában kezelt betegek kapcsán. A vírust mindhárom beteg bronchoalveoláris lavage mintájából kimutattuk teljes genom szekvenálással, direkt PCR vizsgálattal és tenyésztéssel is. Ezen koronavírus által okozott betegséget új koronavírus okozta tüdőgyulladásnak (“novel coronavirus-infected pneumonia” – NCIP) neveztük el. A GISAID (Global Initiative on Sharing All Influenza Data) részére a teljes genomot eljuttattuk. A filogenetikai vizsgálat alapján a SARS-CoV-2 az emberben, a denevérekben és egyéb vadállatokban kimutatott béta-koronavírusok közé sorolható (ide tartozik többek között a SARS, SARS-szerű és egyéb koronavírusok).(15) Cikkünkben kitértünk a vírus izolációs módszerekre, és kezdeti leírást adtunk a vírus specifi kus citopátiás hatásáról és morfológiájáról.
Molekuláris technikákat évtizedek óta sikeresen alkalmazunk fertőző ágensek azonosításában. A nagypontosságú, nagy áteresztőképességű szekvenálás alapvető módszer a patogének felfedezésében.(14,16) A next generation szekvenálás és a bioinformatika a fertőző betegségek okozta járványokkal versenyezve fejlődik, hogy jobban megértsük a betegségek kialakulását és terjedését, felgyorsítsuk a kórokozók azonosítását, a kapott adatokat pedig megosszuk. Jelen cikkünkben a vuhani három súlyos tüdőgyulladásos megbetegedés hátterében álló új típusú béta-koronavírus kapcsán ismertettük a molekuláris technikákat és a nagypontosságú szekvenálást.
Habár humán légúti epiteliális sejtkultúrát létrehozni munkaigényes feladat, értékes kutatási eszköznek bizonyult a humán légúti patogének vizsgálatában.(13) Vizsgálatunkban bemutattuk, hogy a humán légúti váladékok humán légúti epiteliális sejteken történő kezdeti szaporítása, majd transzmissziós elektronmikroszkópiás vizsgálata és a sejttenyészet felülúszójának teljes genom szekvenálása sikeres eszköz volt az új típusú koronavírus megjelenítésében és detektálásában.
Ugyanakkor az ismeretlen légúti kórokozók pontos és gyors azonosítására további új módszerek fejlesztése szükséges. A jelen tanulmányban leírt három komplett genom vizsgálata alapján több specifikus és érzékeny detektálási módszert terveztünk, melyek a SARS-CoV-2 ORF1ab, N, illetve E régiójának virális RNS szekvenciáit célozzák klinikai mintákban. Az említett primerpárok és sztenderd eljárások az Egészségügyi Világszervezettel is megosztva lehetővé teszik a SARS-CoV-2 fertőzések felismerését és nyomon követését mind Kínában mind globálisan. A legfrissebb adatok 830 felismert fertőzöttet mutatnak Kínában. (17)
Bár a jelen tanulmány nem elégíti ki a Koch-féle posztulátumot, a vizsgálati eredményeink arra utalnak, hogy a vuhani járvány kórokozója a SARS-CoV-2. További bizonyítékok, melyek megerősítik a SARS-CoV-2 etiológiai jelentőségét a vuhani járványban: a SARS-CoV-2 antigén kimutatása immunhisztokémiai módszerekkel a betegek tüdőszöveteiben; IgM és IgG antivirális antitestek szerokonverziót jelző kimutatása egy betegben két különböző időpontban; patogenitást bizonyító állatkísérletek (majomban). Kritikus fontosságúak a további epidemiológiai vizsgálatok a fertőzés módjainak, a reprodukciós periódusnak, és a fertőzésből származó klinikai spektrumnak a meghatározására, hogy pontosíthassuk a prevenciós és járványkezelési stratégiákat a SARS-CoV-2 terjedésének megállítására.
Irodalomjegyzék
1. Gao GF. From “A”IV to “Z”IKV: attacks from emerging and re-emerging pathogens. Cell 2018;172:1157-1159.
2. Weiss SR, Leibowitz JL. Coronavirus pathogenesis. Adv Virus Res 2011;81:85-164.
3. Masters PS, Perlman S. Coronaviridae. In: Knipe DM, Howley PM, eds. Fields virology. 6th ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2013:825-58.
4. Su S, Wong G, Shi W, et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends Microbiol 2016;24:490-502.
5. Cui J, Li F, Shi ZL. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nat Rev Microbiol 2019;17:181-192.
6. Zhong NS, Zheng BJ, Li YM, et al. Epidemiology and cause of severe acute respiratory syndrome (SARS) in Guangdong, People’s Republic of China, in February, 2003. Lancet 2003;362:1353-1358.
7. Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, et al. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med 2003;348:1953-1966.
8. Drosten C, Günther S, Preiser W, et al. Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med 2003;348:1967-1976.
9. Zaki AM, van Boheemen S, Bestebroer TM, Osterhaus AD, Fouchier RA. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med 2012;367:1814-1820.
10. Wong G, Liu W, Liu Y, Zhou B, Bi Y, Gao GF. MERS, SARS, and Ebola: the role of super-spreaders in infectious disease. Cell Host Microbe 2015;18:398-401.
11. Report of clustering pneumonia of unknown etiology in Wuhan City. Wuhan Municipal Health Commission, 2019.
12. Liu GS, Li H, Zhao SC, Lu RJ, Niu PH, Tan WJ. Viral and bacterial etiology of acute febrile respiratory syndrome among patients in Qinghai, China. Biomed Environ Sci 2019;32:438-445.
13. Jonsdottir HR, Dijkman R. Coronaviruses and the human airway: a universal system for virus-host interaction studies. Virol J 2016;13:24-24.
14. Palacios G, Druce J, Du L, et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N Engl J Med 2008;358:991-998.
15. Tan WJ, Zhao X, Ma XJ, et al. A novel coronavirus genome identified in a cluster of pneumonia cases — Wuhan, China 2019−2020. China CDC Weekly 2020;2:61-62.
16. Armstrong GL, MacCannell DR, Taylor J, et al. Pathogen genomics in public health. N Engl J Med 2019;381:2569-2580.
17. Report of novel coronavirus-infected pneumonia in Wuhan City. Wuhan Municipal Health Commission, 2020 (http://wjw.wuhan.gov.cn/front/web/showDetail/2020012009077. opens in new tab).
