A SARS-CoV-2 a tüskefehérjéje segítségével szabályozott membránfúzióval fertőzi a T-limfocitákat

Eredeti cikk dátuma: 2020. április 7.
Eredeti cikk címe: SARS-CoV-2 infects T lymphocytes through its spike protein-mediated membrane fusion
Eredeti cikk szerzői: Xinling Wang, Wei Xu, Gaowei Hu, Shuai Xia, Zhiping Sun, Zezhong Liu, Youhua Xie, Rong Zhang, Shibo Jiang, Lu Lu
Eredeti cikk elérhetősége: https://www.nature.com/articles/s41423-020-0424-9
Eredeti cikk státusza:
Fordító(k): dr. Serly Julianna
Lektor(ok): dr. Lomen Eszter
Nyelvi lektor(ok):
Szerkesztő(k): Novák Zsuzsanna

Figyelem! Az oldalon megjelenő cikkek esetenként politikai jellegű megnyilvánulásokat is tartalmazhatnak. Ezek nem tekinthetők a fordítócsoport politikai állásfoglalásának, kizárólag az eredeti cikk írójának véleményét tükrözik. Fordítócsoportunk szigorúan politikamentes, a cikkekben esetlegesen fellelhető politikai tartalommal kapcsolatosan semmiféle felelősséget nem vállal, diskurzust, vitát, bizonyítást vagy cáfolatot nem tesz közzé.

Az oldalon található információk nem helyettesítik a szakemberrel történő személyes konzultációt és kivizsgálást, ezért kérjük, minden esetben forduljon szakorvoshoz!

A COVID-19 új koronavírus-fertőzést a SARS-CoV-2 okozza, a járvány, ami 2019 végén tört ki a kínai Vuhanban1 mára világjárvánnyá vált. A SARS-CoV-2 a bétakoronavírus nemzetségbe tartozik, és genetikailag 79,5%-ban azonos a SARS-CoV-val (ford.: a 2002-ben kitört súlyos akut légzőszervi szindrómát okozó járvány kórokozójával). A SARS-CoV-2 az angiotenzin konvertáló enzim 2 (ACE2) receptorát használja a gazdasejtebe a bejutáshoz2. A COVID-19 klinikai tünetei közé tartozik a tüdőgyulladás, a hasmenés, a nehézlégzés, és a többszervi elégtelenség. Érdekes, hogy a limfocitopénia, ami egy diagnosztikai faktor, gyakori a COVID-19 betegeknél. Xiong et al. szerint a COVID-19 betegeknél a PBMC-kben (perifériás vér mononukleáris sejtekben) az apoptózis, az autofágia és a p53 útvonalak felülszabályozottak3. Néhány vizsgálatban azt találták, hogy a limfocitopénia összefügghet a mortalitással, különösen azoknál a betegeknél, akiknél alacsony CD3⁺, CD4⁺ és CD8⁺ szinteket mértek. A T-limfociták4^,5. A limfocitopéniát a közel-keleti légzőszervi tünetegyüttesben (MERS) szenvedő betegeknél is kimutatták. A MERS-CoV közvetlenül képes fertőzni a humán elsődleges T-limfocitákat, és a T-sejtek aptoptózisát okozza extrinsic (külső faktorok által elindított) és intrinsic (belső faktorok által elindított) aptoptotikus útvonalak révén, de nem tud replikálódni a T-limfocitákban6. Az egyelőre nem világos, vajon a SARS-CoV-2 is képes-e a T-sejtek fertőzésére, ami limfocitopéniához vezet.

Ahhoz, hogy ezt a kérdést megválaszolhassuk, a T-limfociták SARS-CoV-2-fertőzéssel szembeni érzékenységét vizsgáltuk. Ehhez a SARS-CoV és a SARS-CoV-2 vírusok pszeudotípusát (ford.: „pseudotyped”, azaz a vírusburokba más vírusból származó protein kerül) a korábban leírtak szerint alkalmaztuk7. A pszeudovírusok képesek azokat az érzékeny sejteket megfertőzni (293T/ACE2 és Huh7 sejtek), amelyek kifejezik az ACE2-receptort, de nem tudnak nem érzékeny sejteket fertőzni (HeLa sejtek) (1a ábra). A 293T/ACE2 sejteket egyenlően fertőző pszeudovírusokat használtuk ahhoz (1c ábra), hogy két T-limfocita-sejtvonalat, az MT-2-őt és az A3.01-et fertőzzünk, amelyek nagyon alacsony szinten, vagy szinte egyáltalán nem expresszálják a hACE2 mRNS-t (1b ábra). Meglepő módon sok replikációs ciklus elteltével azt láttuk, hogy a T-sejtek sokkal érzékenyebbek voltak a SARS-CoV-2 fertőzésre a SARS-CoV-hoz viszonyítva (1c ábra). Más szóval ezek az eredmények azt jelentik, hogy a T-limfociták érzékenyek lehetnek a SARS-CoV-2 fertőzésre, és kevéssé érzékenyek a SARS-CoV-ra, amit egy korábbi vizsgálat is alátámaszt6. Ezért valószínű, hogy a SARS-CoV-2 S-proteinje irányítja a fertőzés sikerességét, még azoknál a sejteknél is, amelyek alacsony szinten expresszálják a hACE2-őt, és ez magyarázná azt is, hogy a SARS-CoV-2 transzmissziós rátája miért ilyen magas. Az is elképzelhető, hogy más receptorok is befolyásolják a SARS-CoV-2 T-sejtekbe jutását, mint például a CD147, ami a T-limfociták felszínén található8, és amit egy nemrégiben megjelent tanulmányban a SARS-CoV-2 új invazív bejutási útjaként írtak le9.

A T-limfociták érzékenysége a SARS-CoV-2 fertőzéssel szemben. a Fertőzés a SARS-CoV-2 és a SARS-CoV pszeudotípusokkal. A 293T/ACE2 és a Huh7 sejtek érzékenyek, míg a HeLa egy nem érzékeny sejtvonal. b Az ACE2 mRNS expressziója T-sejtekben. A 293T/ACE2 sejtet kontrollként használtuk. c A SARS-CoV-2 és SARS-CoV pszeudotípusokkal fertőzött T-limfocita sejtvonalak. d Az EK1 peptid gátlása a SARS-CoV-2 pszeudotípussal szemben MT-2 sejteken. e A SARS-CoV-2 S-protein irányította sejt-sejt fúzió MT-2 sejteken. Az MT-2 sejteket együtt tenyésztették 293T/SARS-CoV-2/EGFP sejtekkel.

A sejt-sejt fúziót fénymikroszkóppal fényképezték le fluoreszcencia segítségével vagy a látható fény tartományban. A fuzionált sejteket a fehér nyíl jelöli. Méretarány: 800 μm. f A SARS-CoV-2 NP-sejtek kimutatása áramlási citometriával. Az MT-2 sejteket SARS-CoV-2-vel fertőzték sejtenként 1 TCID50-es koncentrációban. A sejteket 24 és 48 órával a fertőzés után fixálták és permeabilizálták, majd immunjelölést alkalmaztak a SARS-CoV-2 NP kimutatására. g Az MT-2 sejtek fertőzése a SARS-CoV-2-vel sikertelen. A sejteket egyenként 1 TCID50-es koncentrációban fertőzték SARS-CoV-2-vel, és a fertőzés után 1, 6, 24 és 48 órával összegyűjtötték. A sejtlizátumot (fent) és a felülúszót (lent) is összegyűjtötték az RT-qPCR-el végzett virális N-gén kimutatásához. Az egyes képeken a jelölők és a hibavonalak az átlagot és a szórást jelölik. A statisztikai analízishez a független mintás t-próbát használták. *p < 0,05

Ahhoz, hogy kiderítsük, a SARS-CoV-2 beléphet-e a T-limfocitákba a nem receptormediálta endocitózissal, az EK1 peptidet használtuk, amiről ismert, hogy gátolja a SARS-CoV-2 tüskefehérjéje (S) által irányított sejt-sejt fúziót, és a pszeudovírusos fertőzést7^,10. Ez az anyag a receptormediálta fertőzést a HR1 interakció révén gátolja, ami megakadályozza a hatos hélixköteg kialakulását (6-HB), tovább akadályozva ezzel a vírus és a célsejt membránjának fúzióját. Vizsgálataink alapján az EK1 peptid szignifikánsan gátolja a SARS-CoV-2 pszeudovírusokat az MT-2 sejteken (1d ábra), ami miatt feltételezhető, hogy a vírus bejutása a sejtbe a receptormediálta fúziótól függ. Az EK1 csak magas koncentrációban (40 μM) gátolja az aktivitást MT-2 sejteken. Ehhez képest az EK1 IC50 értéke 2,38 μM volt a 293T/ACE2 sejteken10. Ezekből az eredményekből arra lehet következtetni, hogy a SARS-CoV-2 szintén a receptormediálta endocitózis útvonalon jut be a T-limfocitákba is. Hogy ezt tisztázzuk, elvégeztünk a korábbi tanulmányokban már leírt SARS-CoV-2 S-mediálta sejt-sejt fúziós vizsgálatot7^,10. Az együttes tenyésztés után 48 órával a SARS-CoV-2 S-proteinjét expresszáló 293T sejtek fuzionáltak az MT-2 sejtekkel. Összehasonlítva a nem fuzionált sejtekkel, a fuzionált sejtek egy helyen csoportosultak, ami nagy méretű halványzöld fluoreszcens területként látszódott. Ezzel szemben nem voltak fellelhetők a SARS-CoV tenyészetben fuzionált sejtek (1e ábra). Ezért ebből azt a következtetést lehet levonni, hogy a SARS-CoV-2 az S-protein-mediálta memránfúzió segítségével fertőzheti a T-sejteket.

Ahhoz, hogy meghatározzuk az MT-2 sejtek érzékenységét a valódi vírussal szemben, a SARS-CoV-2-t használtuk az MT-2 sejtek fertőzéséhez, és a korábban ismertetett módon detektáltuk a SARS-CoV-2 nukleoproteinjét (NP) a sejtekben6. Érdekes, hogy sok MT-2 sejt fertőződött meg SARS-CoV-2-vel (1f ábra). Számszerűsítve, a SARS-CoV-2 NP-pozitív MT-2 sejtek aránya 23,11%-kal magasabb volt a nem fertőzött sejtekhez képest 24 órával a fertőzés után, ami kb. 4,6-szoros érték az 1 órás értékhez képest (1f ábra). Ez az eredmény azt jelenti, hogy a vírus bejutott az MT-2 sejtekbe 24 órával később, tehát megfertőzte őket.

Mivel a MERS-CoV hatékonyan tudja fertőzni a T-limfocitákat, de nem tud replikálódni bennük6, különböző időpontokban vizsgáltuk a vírusgenom kópiaszámát a fertőzés után, hogy kiderítsük a SARS-CoV-2 replikációs jellemzőit MT-2 sejtekben. Hasonlóképpen a MERS-CoV-hoz, a SARS-CoV-2 sem tudott replikálódni az MT-2 sejtekben (1g ábra). A sejtlizátumban a vírusgenom kópiaszáma 6 órával a fertőzés után szignifikánsabb magasabb volt, mint a többi időpontban, de végig állandó maradt a felülúszóban. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a SARS-CoV-2 az MT-2 sejtekbe 6 órával a fertőzés után juthat be, de nem replikálódik, és ezután a vírus RNS elkezd lebomlani. A felülúszóban detektált víruskópiaszám származhat a háttér maradék virionból, hasonlóan a korábbi MERS-CoV vizsgálatok eredményeihez (1g ábra)6.

A pszeudovírussal és a valódi vírussal történt fertőzések eredményeire alapozva bizonyítottuk, hogy (1) a SARS-CoV-2 képes a T-sejteket fertőzni, (2) a SARS-CoV-2 a T-sejteket receptorfüggően, az S-protein irányította membránfúzió segítségével fertőzi, és (3) a fertőzést gátolni lehet az EK1 peptiddel. A T-sejtekben nagyon alacsony szintű hACE2-expressziót figyeltünk meg, ezért azt feltételezzük, hogy valamilyen új receptor segítheti a SARS-CoV-2 bejutását a T-sejtekbe. A MERS-CoV-hoz hasonlóan a T-sejtek SARS-CoV-2 fertőzése is sikertelen volt. Egy nemrégiben megjelent tanulmány szerint a COVID-19 betegekből származó PBMC mintákban alig tudták kimutatni a vírus readeket RNS transzkriptom-szekvenálással. Ezért ebből arra következtettek, hogy a SARS-CoV-2 nem tudja a PBMC-ket fertőzni. A PBMC transzkriptomának jellemzésére és elemzésére három betegből származtak a minták. Két SARS-CoV-2 leolvasást (readet) detektáltak az egyik beteg PBMC mintájából, és egyet sem egy másikéből3. Az eredmény hozzájárulhatott a SARS-CoV-2 eredménytelen replikációjához a T-limfocitákban, mivel a PBMC-kben jelenlevő kis mennyiségű vírusgenom lebomolhatott a mintagyűjtés vagy az RNS extrakciója során. Ezért az elsődleges T-sejtekben a SARS-CoV-2 fertőzésével és replikációjával kapcsolatos kérdések, valamint annak megértése, hogyan okoz apoptózist a T-sejtekben a vírusfertőzés, további kutatást igényelnek, ami lehetővé teszi, hogy a patogén mechanizmusokkal és terápiás beavatkozásokkal kapcsolatos új ötletekkel álljanak elő.

Irodalom

1. Jiang, S. et al. A distinct name is needed for the new coronavirus. Lancet https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30419-0 (2020).
2. Zhou, P. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579, 270–273 (2020).
3. Xiong, Y. et al. Transcriptomic characteristics of bronchoalveolar lavage fluid and peripheral blood mononuclear cells in COVID-19 patients. https://doi.org/10.2139/ssrn.3549993 (2020).
4. Zeng, Q. et al. Mortality of COVID-19 is Associated with Cellular Immune Function Compared to Immune Function in Chinese Han Population (2020). Preprint at https://doi.org/10.1101/2020.03.08.20031229 (2020).
5. Zheng, M. et al. Functional exhaustion of antiviral lymphocytes in COVID-19 patients. Cell. Mol. Immunol. https://doi.org/10.1038/s41423-020-0402-2 (2020).
6. Chu, H. et al. Middle east respiratory syndrome coronavirus efficiently infects human primary T lymphocytes and activates the extrinsic and intrinsic apoptosis pathways. J. Infect. Dis. 213, 904–914 (2016).
7. 7.Xia, S. et al. A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike. Sci. Adv. 5, eaav4580 (2019).
8. 8.Koch, C. et al. T cell activation-associated epitopes of CD147 in regulation of the T cell response, and their definition by antibody affinity and antigen density. Int. Immunol. 11, 777–786 (1999).
9. 9.Wang, K. et al. SARS-CoV-2 invades host cells via a novel route: CD147-spike protein. Preprint at https://doi.org/10.1101/2020.03.14.988345 (2020).
10. 10.Xia, S. et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infection (previously 2019-nCoV) by a highly potent pan-coronavirus fusion inhibitor targeting its spike protein that harbors a high capacity to mediate membrane fusion. Cell Res. https://doi.org/10.1038/s41422-020-0305-x (2020).

További információk a t-limfocitákról, és a SARS-CoV-2 egyedi jellemzőiről itt.