Eredeti cikk dátuma: 2020. május 6.
Eredeti cikk címe: Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2
Eredeti cikk szerzői: Qiang Gao, Linlin Bao2, Haiyan Mao, Lin Wang, Kangwei Xu, Minnan Yang, Yajing Li, Ling Zhu, Nan Wang, Zhe Lv, Hong Gao, Xiaoqin Ge, Biao Kan, Yaling Hu, Jiangning Liu, Fang Cai, Deyu Jiang, Yanhui Yin, Chengfeng Qin, Jing Li, Xuejie Gong, Xiuyu Lou, Wen Shi, Dongdong Wu, Hengming Zhang, Lang Zhu, Wei Deng, Yurong Li, Jinxing Lu, Changgui Li, Xiangxi Wang, Weidong Yin, Yanjun Zhang, Chuan Qin
Eredeti cikk elérhetősége: https://science.sciencemag.org/content/early/2020/05/06/science.abc1932
Fordító(k): dr. Szabó Edit
Lektor(ok): dr. Kun Ildikó
Nyelvi lektor(ok): Rét Anna
Szerkesztő(k): Kovács László

Figyelem! Az oldalon megjelenő cikkek esetenként politikai jellegű megnyilvánulásokat is tartalmazhatnak. Ezek nem tekinthetők a fordítócsoport politikai állásfoglalásának, kizárólag az eredeti cikk írójának véleményét tükrözik. Fordítócsoportunk szigorúan politikamentes, a cikkekben esetlegesen fellelhető politikai tartalommal kapcsolatosan semmiféle felelősséget nem vállal, diskurzust, vitát, bizonyítást vagy cáfolatot nem tesz közzé.


Absztrakt

A súlyos akut légszőszervi tünetegyüttest okozó koronavírus 2 (SARS-CoV-2) által kiváltott koronavírus-betegség 2019 (COVID19) világjárványa példátlan közegészségügyi krízist idézett elő. Új vírus révén jelenleg nem állnak rendelkezésre SARS-CoV-2-specifikus kezelések vagy vakcinák. Ezért sürgősen szükség van a SARS-CoV-2 elleni hatékony vakcinák gyors kifejlesztésére. Itt kidolgoztunk egy kísérleti jellegű tisztított, inaktivált SARS-CoV-2 vírus vakcinajelöltet (PiCoVacc), amely SARS-CoV-2-specifikus neutralizáló antitesteket indukált egerekben, patkányokban és nem emberszabású főemlősökben. Ezek az antitestek semlegesítettek 10 reprezentatív SARS-CoV-2-vírustörzset, ami arra utal, hogy a SARS-CoV-2-vírustörzsekkel szemben szélesebb körű neutralizációra képesek. Három immunizálás két különféle dózissal (adagonként 3 μg vagy 6 μg) részleges vagy teljes védelmet nyújtott makákókban a SARS-CoV-2-fertőzés ellen anélkül, hogy az ellenanyagfüggő fertőzésfokozódás megfigyelhető lett volna. Ezek az adatok alátámasztják a SARS-CoV-2-vakcinák klinikai fejlesztését az emberek számára.

Az Egészségügyi Világszervezet a koronavírus-betegség 2019 (COVID19) kitörését 2020. január 30-án nemzetközi jelentőségű közegészségügyi vészhelyzetnek, majd 2020. március 11-én világjárványnak nyilvánította. A COVID19-betegek kb. 80%-ánál jelentettek enyhe vagy közepesen súlyos tüneteket, míg kb. 20%-uknál súlyos tüneteket, mint például súlyos tüdőgyulladás, akut légzési distressz szindróma (ARDS), szepszis vagy akár halál is (1). A COVID19-esetek száma megdöbbentő mértékben nőtt világszerte. A súlyos akut légzőszervi szindrómát okozó koronavírus 2 (SARS-CoV-2), a folyamatban lévő pandémia kórokozó vírusa a Coronaviridae család Betacoronavirus (β-CoV) genusba tartozik (2). A SARS-CoV-2, valamint a súlyos akut légzőszervi szindrómát okozó koronavírus (SARS-CoV) és a közel-keleti légzőszervi szindrómát okozó koronavírus (MERS-CoV) képezik a három legveszélyesebb fajt az összes emberi koronavírus közül. A SARS-CoV-2 lineáris egyszálú pozitív RNS-genomot tartalmaz, amely 4 szerkezeti fehérjét kódol [tüske (S), burok (E), membrán (M) és nukleokapszid (N)]. Ezek közül az S egy fő védő antigén, amely erősen neutralizáló antitesteket (NAbs), 16 nem strukturális fehérjét (nsp1-nsp16) és számos kiegészítő proteint jelenít meg (3). Jelenleg nem állnak rendelkezésre specifikus vírusellenes gyógyszerek vagy vakcinák az újonnan megjelent SARS-CoV-2 ellen. Ezért a vakcinák fejlesztésének sürgőssége alapvető fontosságú a világjárvány megfékezése és az új járvány megelőzése érdekében.

Több SARS-CoV-2 vakcinatípus, például DNS-, RNS-alapú készítmények, vírusepitópokat tartalmazó rekombináns alegységek, adenovírus-alapú vektorok és tisztított inaktivált vírusok állnak fejlesztés alatt (4–6). Tisztított inaktivált vírusokat hagyományosan használnak vakcinák kifejlesztésére, és az ilyen vakcinák biztonságosnak és hatásosnak bizonyultak olyan vírusok által okozott betegségek megelőzésében, mint az influenzavírus és a poliovírus (7, 8). SARS-CoV-2 vakcinajelölt preklinikai in vitro neutralizációs és ún. challenge-modelljeinek (fertőzésnek való szándékos kitettség) kidolgozása érdekében SARS-CoV-2-törzseket 11 kórházi ápolással kezelt beteg (köztük 5 intenzív kezelésben részesülő beteg) bronchoalveoláris lavage (BALF) mintájából izoláltuk. Ezek közül 5 Kínából, 3 Olaszországból, 1 Svájcból, 1 az Egyesült Királyságból és 1 Spanyolországból származik (S1 táblázat). Ezek a betegek a jelenlegi járványkitörés során SARS-CoV-2-vel fertőződtek meg. A 11 minta olyan SARS-CoV-2-törzseket tartalmazott, amelyek széles körben találhatók szétszórtan a rendelkezésre álló szekvenciákból felépített filogenetikai fán, és bizonyos mértékben reprezentálják a keringő SARS-CoV-2-populációkat (1A ábra és S1 ábra). A CN2 törzset választottuk ki a tisztított, inaktivált SARS-CoV-2-vírusvakcina (PiCoVacc) fejlesztésére, és további 10 törzset (CN1, CN3–CN5 és OS1–OS6 nevűek) preklinikai challenge vírustörzsnek választottunk. Megjegyzendő, hogy a CN1 és az OS1 törzsek szorosan kapcsolódnak a 2019-nCoV-BetaCoV/Vuhan/ WIV04/2019 és az EPI_ISL_412973 törzsekhez, amelyek a beszámolók szerint súlyos klinikai tüneteket, köztük gépi lélegeztetést igénylő légzési elégtelenséget okoztak (9, 10).

1. ábra. PiCoVacc, SARS-CoV-2 vakcinajelölt jellemzése.

(A) A SARS-CoV-2 legnagyobb valószínűség alapján készült filogenetikai fája. A vizsgálatban használt SARS-CoV-2-izolátumokat fekete vonallal ábrázoltuk és megjelöltük. A vírustörzseket olyan fertőzött betegekből izoláltuk, akik a megjelölt kontinensekről utaztak el. (B) A PiCoVacc (CN2) P5 törzs növekedési kinetikája a Vero-sejtekben. (C) A PiCoVacc elkészítésének folyamatábrája. (D) A PiCoVacc fehérjeösszetételének és tisztaságának meghatározása NuPAGE 4–12% Bis-Tris gélen. (E) A PiCoVacc reprezentatív elektronmikroszkópos képe. Fehér léptéksáv = 100 nm.

A PiCoVacc gyártásához Vero-sejtekben hatékony növekedésre adaptált vírusállomány előállítása céljából a CN2 törzset először plakkokkal tisztítottuk, és egyszer passzáltuk Vero-sejtekben a P1 állomány létrehozásához. Ezután újabb négy passzálást hajtottunk végre a P2–P5 állományok előállítása céljából. A P5 állomány növekedési kinetikájának elemzése a Vero-sejtekben kimutatta, hogy ez az állomány hatékonyan replikálódik, és a fertőzés után 3 vagy 4 nappal (dpi) elérte a 6-7 log10 TCID50/ml 0,0001–0,01 fertőzési tömeget (fertőzés multiplicitása, MOI) 33°C és 37°C közötti hőmérsékleten (1B ábra). A PiCoVacc genetikai stabilitásának kiértékeléséhez további 5 passzálást végeztünk a P10 állomány kinyerésére, amelynek teljes genomját a P1, P3 és P5 állományokkal együtt szekvenáltuk. A P1-hez képest csak két aminosavszubsztitúció fordult elő, az Ala → Asp az E 32-es aminosavnál (E-A32D) és Thr → Ile a 49-es nsp10 aminosavnál (nsp10-T49I) a P5 és a P10 állományokban (S2 táblázat), ami arra utal, hogy a PiCoVacc CN2 törzs kiváló genetikai stabilitással rendelkezik S mutációk nélkül, amelyek potenciálisan megváltoztathatják a NAb epitópokat. Az állatokon végzett vizsgálatokhoz szükséges kísérleti PiCoVacc előállításához a vírust 50 liter Vero-sejt-tenyészetében szaporítottuk a Cell Factory rendszer alkalmazásával, és β-propiolakton alkalmazásával inaktiváltuk (1C ábra). A vírust mélyszűrés és kromatográfia két optimalizált lépését alkalmazva tisztítottuk, így rendkívül tiszta PiCoVacc készítményt kaptunk (1D ábra). Ezenkívül a krioelektronmikroszkópos (cryo-EM) vizsgálat érintetlen ovális alakú, 90-150 nm átmérőjű részecskéket mutatott, amelyeket koronaszerű tüskék díszítenek, és amelyek a vírus prefúziós állapotát jelzik (1E ábra).

A PiCoVacc immunogenitásának felméréséhez a BALB/c egerek csoportjait (n = 10) a 0. és 7. napon különféle PiCoVacc-dózisokkal injektáltuk timsó-adjuvánssal keverve (0, 1,5 vagy 3 vagy 6 μg adagonként, 0 μg fiziológiás sóoldatban az álvakcinacsoportban). Nem észleltünk gyulladást vagy más nemkívánatos hatást. A tüske (S)-, receptorkötő domén (RBD)- és az N-specifikus antitestválaszokat enzim-kapcsolt immunszorbens vizsgálatokkal (ELISA) értékeltük az első immunizálás utáni 1–6. héten (S2 ábra). A SARS-CoV-2 S- és RBD-specifikus immunoglobulin G (Ig G) gyorsan kialakult a beoltott egerek szérumában, és a csúcspontja 819 200 (> 200 μg/ml) és 409 600 (> 100 μg/ml) titernél volt a 6. héten (2A ábra). Az RBD-specifikus IgG adja az S-indukált antitestválaszok felét, ami arra utal, hogy az RBD az uralkodó immunogén, ami szorosan megegyezik a gyógyult COVID19-betegek vérének szerológiai profiljával (2. ábra A és B) (11). Meglepő módon az indukált N-specifikus IgG mennyisége kb. 30-szor alacsonyabb, mint az S vagy RBD elleni antitestek immunizált egerekben (2A ábra). A korábbi vizsgálatok érdekessége, hogy az N-specifikus IgG nagy mennyiségben van jelen a COVID19-betegek szérumában, és egyik klinikai diagnosztikai markerként szolgál (11). Érdemes megjegyezni, hogy a PiCoVacc kb. tízszer magasabb S-specifikus antitesttitereket tud kiváltani egerekben, mint ami a gyógyult COVID19-betegek szérumából származik (2. ábra A és B). Bár ez a megfigyelés jelenleg nem jelzi a PiCoVacc azon képességét, hogy hasonló eredményeket mutasson az embereken, mégis kiemeli, hogy a PiCoVacc képes erős és potenciális immunválaszt indukálni. Összegezve, eredményeink – azzal a ténnyel együtt, hogy a SARS-CoV-2 N-t megcélzó antitestek nem biztosítanak védő immunitást a fertőzés ellen (12) – arra utalnak, hogy a PiCoVacc képes lehet hatékonyabb antitestválasz kiváltására (2. ábra A és B).

2. ábra A PiCoVacc-immunizálás neutralizáló antitestválaszt vált ki tíz reprezentatív SARS-CoV-2 izolátum ellen.

BALB/c egereket és Wistar patkányokat immunizáltak különböző dózisú PiCoVacc-kal vagy kontrollal (csak adjuvánst adtak a kontrollcsoportnak) (n=10). Felgyógyult COVID19-betegek (RECOV) és nem fertőzött egyének (NI) szérumát használták pozitív és negatív kontrollként. Az antitestválaszokat egérben (A), emberben (B) és patkányban (C) elemezték. Fent: A SARS-CoV-2-specifikus IgG-válaszokat ELISA-val mérték; lent: a neutralizáló antitesttitert mikroneutralizációs eljárással határozták meg. A PiCoVacc által kiváltott neutralizációs aktivitás spektrumát egérben (D) és patkányban (E) vizsgálták. A neutralizációs eljáráshoz a többi kilenc SARS-CoV-2 izolátum elleni egér- és patkányszérumot gyűjtöttek 3 héttel az vakcináció után. Az adatpontok az állatokkal és emberrel végzett öt-tíz egyedi kísérletből származó átlag +/− SEM értékeit mutatják; a hibasávok a SEM-et tükrözik; a szaggatott vonalak a kimutatási határt, a vízszintes vonalak pedig az egyes csoportok EC50 geometriai átlagtiterét (GMT) jelzik.





3. ábra. A PiCoVacc immunogenitása és védőhatása nem emberi főemlősökben.

A SARS és a MERS vakcinajelöltek kifejlesztéséről szóló korábbi jelentések aggodalmakat vetettek fel a tüdő immunpatológiájával kapcsolatban, amely akár közvetlenül a 2. típusú helper T-sejt (Th2) válasz, akár az ADE következménye lehet (4, 14, 15). Noha számos vakcina által kiváltott T-sejtes válaszról bebizonyosodott, hogy döntő a jelentősége az akut víruseliminációban, a további koronavírus-fertőzésekkel szembeni védelmet nagyrészt a humorális immunitás közvetíti (16, 17). A túlzott T-sejtes válaszok által kiváltott „citokinvihar” valójában a COVID19 patogenezisét hangsúlyozza (18, 19). Ezért a SARS-CoV-2 vakcinák által kiváltott T-sejtes válaszokat szükséges jól kontrollálni az immunpatológia elkerülése érdekében. Ebben az összefüggésben szisztematikusan értékeljük a PiCoVacc biztonságosságát a makákókban, számos klinikai megfigyelés és biológiai mutató rögzítésével. Két makákócsoportot (n = 10) intramuszkuláris injekcióval alacsony (1,5 μg) vagy nagy dózisokkal (6 μg) immunizáltunk, és két másik makákócsoportot (n = 10) adjuvánssal (álvakcina) és fiziológiás sóoldattal (placebo) immunizáltunk három alkalommal, a 0., 7. és 14. napon. A PiCoVacc-immunizálást követően egy makákóban sem észleltünk lázat vagy fogyást, és az összes állat étvágya és mentális állapota normális maradt (S3 ábra). A hematológiai és biokémiai elemzés, beleértve a biokémiai vérvizsgálatot, a limfocita-alcsoportok százalékát (CD3+, CD4+ és CD8+) és a kulcsfontosságú citokineket (TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5 és IL-6), nem mutatott figyelemre méltó változásokat a vakcinázott csoportokban az álvakcina- és a placebocsoporthoz képest (4. ábra A és B, valamint S4 és S5 ábra). Ezenkívül a 29. napon a 4 csoportból származó különféle szervek, köztük a tüdő, szív, lép, máj, vese és agy kórszövettani vizsgálata azt mutatta, hogy a PiCoVacc nem okozott figyelemre méltó patológiai elváltozást a makákókban (4C ábra és S6 ábra).

4. ábra. A PiCoVacc biztonságosságának vizsgálata nem emberi főemlősökben.

A makákókat három alkalommal, a 0., 7. és 14. napon intramuszkulárisan immunizáltuk a PiCoVacc alacsony (1,5 μg adagonként) vagy nagy dózisával (6 μg adagonként), vagy csak adjuvánssal (álvakcina), vagy placebóval. (A és B) Hematológiai vizsgálat mind a négy makákócsoportban (n = 4). A limfocita-alcsoportok százalékát (A), beleértve a CD3+, CD4+ és CD8+ értékeket, a –1. napon (a vakcinázás előtt 1 nappal), a 18. napon (a második oltás után 3 nappal) és a 29. napon (a harmadik oltást követő 7. napon) figyeltük meg. A TNF-α, IFN-y és IL-2 kulcsfontosságú citokineket (B) a –1. napon, az 1. napon (az első oltás napja) és az oltás utáni 4., 18. és 29. napon vizsgáltuk. Az összes adatot négy független kísérlet átlag ± SD-ként mutatjuk be; a hibajelző táblák a standard deviációt (SD) tükrözik. (C) A tüdő hiszpatológiás kiértékelése a makákók négy csoportjában a 29. napon. Tüdőszövetet gyűjtöttünk, és megfestettük hematoxilin-eozinnal.

A jelenlegi súlyos COVID19-világjárvány és a világszerte rohamosan növekvő halálesetek egy SARS-CoV-2-oltás sürgős kifejlesztését teszik szükségessé, és új pandémiás paradigmát igényelnek. A biztonságosság és a hatásosság elengedhetetlen a vakcinafejlesztés mindkét szakaszában, a preklinikai vizsgálatokban és a klinikai vizsgálatokban egyaránt. Bár még mindig túl korai meghatározni a legalkalmasabb állatmodellt a SARS-CoV-2-fertőzések tanulmányozására, a SARS-CoV-2-fertőzés után COVID19-szerű tüneteket utánzó rézuszmakákók ígéretes állatmodellnek tűnnek a betegség tanulmányozására. Bizonyítékokat szolgáltattunk a PiCoVacc biztonságosságához makákókban, és tanulmányainkban nem figyeltünk meg a fertőzésfokozódást vagy az immunopatológia súlyosbodását. Adataink azt is bizonyítják, hogy a PiCoVacc dózisonkénti 6 μg-ja teljes védelmet nyújt a SARS-CoV-2-fertőzés ellen makákókban. Ezek az eredmények együttesen utat mutatnak a SARS-CoV-2-oltások emberi alkalmazásra irányuló klinikai fejlesztéséhez. I., II. és III. fázisú klinikai vizsgálatok PiCoVacc-kal, valamint más lehetséges SARS-CoV-2-oltóanyagokkal várhatóan ebben az évben elkezdődnek.

Irodalom

  1. Z. Wu, J. M. McGoogan, Characteristics of and important lessons from the coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak in China: Summary of a report of 72,314 cases from the Chinese Center for Disease Control and Prevention. JAMA 323, 1239–1242 (2020). doi:10.1001/jama.2020.2648pmid:32091533
  2. Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses, The species severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: Classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat. Microbiol. 5, 536–544 (2020). doi:10.1038/s41564-020-0695-zpmid:32123347
  3. A. Wu, Y. Peng, B. Huang, X. Ding, X. Wang, P. Niu, J. Meng, Z. Zhu, Z. Zhang, J. Wang, J. Sheng, L. Quan, Z. Xia, W. Tan, G. Cheng, T. Jiang, Genome composition and divergence of the novel coronavirus (2019-nCoV) originating in China. Cell Host Microbe 27, 325–328 (2020). doi:10.1016/j.chom.2020.02.001pmid:32035028
  4. N. Lurie, M. Saville, R. Hatchett, J. Halton, Developing Covid-19 vaccines at pandemic speed. N. Engl. J. Med. 10.1056/NEJMp2005630 (2020). doi:10.1056/NEJMp2005630pmid:32227757
  5. K. Dhama, K. Sharun, R. Tiwari, M. Dadar, Y. S. Malik, K. P. Singh, W. Chaicumpa, COVID-19, an emerging coronavirus infection: Advances and prospects in designing and developing vaccines, immunotherapeutics, and therapeutics. Hum. Vaccin. Immunother. 10.1080/21645515.2020.1735227 (2020). doi:10.1080/21645515.2020.1735227pmid:32186952
  6. E. Kim, G. Erdos, S. Huang, T. W. Kenniston, S. C. Balmert, C. D. Carey, V. S. Raj, M. W. Epperly, W. B. Klimstra, B. L. Haagmans, E. Korkmaz, L. D. Falo Jr., A. Gambotto, Microneedle array delivered recombinant coronavirus vaccines: Immunogenicity and rapid translational development. EBioMedicine 102743 (2020). doi:10.1016/j.ebiom.2020.102743pmid:32249203
  7. A. D. Murdin, L. Barreto, S. Plotkin, Inactivated poliovirus vaccine: Past and present experience. Vaccine 14, 735–746 (1996). doi:10.1016/0264-410X(95)00211-Ipmid:8817819
  8. C. Vellozzi, D. R. Burwen, A. Dobardzic, R. Ball, K. Walton, P. Haber, Safety of trivalent inactivated influenza vaccines in adults: Background for pandemic influenza vaccine safety monitoring. Vaccine 27, 2114–2120 (2009). doi:10.1016/j.vaccine.2009.01.125pmid:19356614
  9. P. Stefanelli, G. Faggioni, A. Lo Presti, S. Fiore, A. Marchi, E. Benedetti, C. Fabiani, A. Anselmo, A. Ciammaruconi, A. Fortunato, R. De Santis, S. Fillo, M. R. Capobianchi, M. R. Gismondo, A. Ciervo, G. Rezza, M. R. Castrucci, F. Lista; On Behalf of Iss Covid-Study Group, Whole genome and phylogenetic analysis of two SARS-CoV-2 strains isolated in Italy in January and February 2020: Additional clues on multiple introductions and further circulation in Europe. Euro. Surveill. 25, 2000305 (2020). doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.13.2000305pmid:32265007
  10. P. Zhou, X.-L. Yang, X.-G. Wang, B. Hu, L. Zhang, W. Zhang, H.-R. Si, Y. Zhu, B. Li, C.-L. Huang, H.-D. Chen, J. Chen, Y. Luo, H. Guo, R.-D. Jiang, M.-Q. Liu, Y. Chen, X.-R. Shen, X. Wang, X.-S. Zheng, K. Zhao, Q.-J. Chen, F. Deng, L.-L. Liu, B. Yan, F.-X. Zhan, Y.-Y. Wang, G.-F. Xiao, Z.-L. Shi, A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579, 270–273 (2020). doi:10.1038/s41586-020-2012-7pmid:32015507CrossRefPubMedGoogle Scholar
  11. L. Liu, S. Wang, S. Zheng, A preliminary study on serological assay for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in 238 admitted hospital patients. MedRxiv 2020.03.06.20031856 [Preprint]. 8 March 2020; doi:10.1101/2020.03.06.20031856
  12. L. E. Gralinski, V. D. Menachery, Return of the coronavirus: 2019-nCoV. Viruses 12, E135 (2020). doi:10.3390/v12020135pmid:31991541
  13. P. Yu, F. Qi, Y. Xu, F. Li, P. Liu, J. Liu, L. Bao, W. Deng, H. Gao, Z. Xiang, C. Xiao, Q. Lv, S. Gong, J. Liu, Z. Song, Y. Qu, J. Xue, Q. Wei, M. Liu, G. Wang, S. Wang, H. Yu, X. Liu, B. Huang, W. Wang, L. Zhao, H. Wang, F. Ye, W. Zhou, W. Zhen, J. Han, G. Wu, Q. Jin, J. Wang, W. Tan, C. Qin, Age-related rhesus macaque models of COVID-19. Animal Model. Exp. Med. 3, 93–97 (2020). doi:10.1002/ame2.12108pmid:32318665
  14. C. T. Tseng, E. Sbrana, N. Iwata-Yoshikawa, P. C. Newman, T. Garron, R. L. Atmar, C. J. Peters, R. B. Couch, Correction: Immunization with SARS coronavirus vaccines leads to pulmonary immunopathology on challenge with the SARS virus. PLOS ONE 7, e35421 (2012). doi:10.1371/annotation/2965cfae-b77d-4014-8b7b-236e01a35492pmid:22536382
  15. C. Y. Yong, H. K. Ong, S. K. Yeap, K. L. Ho, W. S. Tan, Recent advances in the vaccine development against Middle East respiratory syndrome-coronavirus. Front. Microbiol. 10, 1781 (2019). doi:10.3389/fmicb.2019.01781pmid:31428074
  16. E. Prompetchara, C. Ketloy, T. Palaga, Immune responses in COVID-19 and potential vaccines: Lessons learned from SARS and MERS epidemic. Asian Pac. J. Allergy Immunol. 38, 1–9 (2020). pmid:32105090
  17. J. Zhao, R. A. P. M. Perera, G. Kayali, D. Meyerholz, S. Perlman, M. Peiris, Passive immunotherapy with dromedary immune serum in an experimental animal model for Middle East respiratory syndrome coronavirus infection. J. Virol. 89, 6117–6120 (2015). doi:10.1128/JVI.00446-15pmid:25787284
  18. J. M. Nicholls, L. L. M. Poon, K. C. Lee, W. F. Ng, S. T. Lai, C. Y. Leung, C. M. Chu, P. K. Hui, K. L. Mak, W. Lim, K. W. Yan, K. H. Chan, N. C. Tsang, Y. Guan, K. Y. Yuen, J. S. Peiris, Lung pathology of fatal severe acute respiratory syndrome. Lancet 361, 1773–1778 (2003). doi:10.1016/S0140-6736(03)13413-7pmid:12781536
  19. H. Y. Zheng, M. Zhang, C. X. Yang, N. Zhang, X. C. Wang, X. P. Yang, X. Q. Dong, Y. T. Zheng, Elevated exhaustion levels and reduced functional diversity of T cells in peripheral blood may predict severe progression in COVID-19 patients. Cell. Mol. Immunol. 17, 541–543 (2020). doi:10.1038/s41423-020-0401-3pmid:32203186
  20. J. Miller, R. Ulrich, On the analysis of psychometric functions: The Spearman-Kärber method. Percept. Psychophys. 63, 1399–1420 (2001). doi:10.3758/BF03194551pmid:11800465
  21. L. T. Nguyen, H. A. Schmidt, A. von Haeseler, B. Q. Minh, IQ-TREE: A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies. Mol. Biol. Evol. 32, 268–274 (2015). doi:10.1093/molbev/msu300pmid:25371430
  22. G. C. Yu, D. K. Smith, H. C. Zhu, Y. Guan, T. T. Y. Lam, GGTREE: An R package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods Ecol. Evol. 8, 28–36 (2017). doi:10.1111/2041-210X.12628
  23. N. Wang, D. Zhao, J. Wang, Y. Zhang, M. Wang, Y. Gao, F. Li, J. Wang, Z. Bu, Z. Rao, X. Wang, Architecture of African swine fever virus and implications for viral assembly. Science 366, 640–644 (2019). doi:10.1126/science.aaz1439pmid:31624094